基于網絡藥理學研究厚樸-杏仁治療哮喘的潛在作用機制

李煥敏，李新民，孫丹，韓耀巍，孫婷，律揚，陳鴻祥

(天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381)

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應為特征的異質性疾病，臨床以反復發作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀為主要表現，常在夜間和/或凌晨發作或加劇。調查顯示，1990—2015年哮喘的患病率增加12.6%，占據1.1%的全球疾病負擔[1]。哮喘的治療主要通過吸入糖皮質激素和β2受體激動劑[2]，二者雖對哮喘的急性發作具有重要控制作用，然而緩解期激素類藥物的長期使用，容易出現副作用，尤其影響兒童患者的生長發育。中醫藥治療哮喘經驗豐富，很多證據表明其在治療哮喘時安全有效[3]，不僅可以緩解哮喘發作，還能從整體調節患者體質，增強患者抗病能力，副作用小，故常被單獨或聯合用于哮喘緩解期的治療。

《傷寒論》第18條記載“喘家作桂枝湯，加厚樸杏子佳”，指出桂枝加厚樸杏子湯可治療宿有喘病，又感風寒而見桂枝湯證者，或風寒表證誤用下劑后，表證未解而微喘者。方中厚樸驅除痰涎，疏利氣雍，杏仁定喘鎮咳，兩者相佐以下氣逆，常被臨床醫家應用于哮喘及咳嗽伴喘息發作等疾病的治療[4-5]。現代研究表明，厚樸的有效成分厚樸酚能降低哮喘小鼠VEGF的表達，延緩氣道重構的發生[6]；杏仁的有效成份苦杏仁苷能有效減輕支氣管哮喘小鼠氣管黏膜下層炎性細胞浸潤[7]。厚樸、杏仁在治療哮喘時常配伍應用，現代藥理學雖然對其在治療哮喘中的有效成分有一定研究，但其協同治療的作用機制尚不明確。網絡藥理學整體性、系統性的研究策略與中藥在治療疾病方面的多成分、多途徑、多靶點的作用原理十分契合。本研究應用網絡藥理學方法，對厚樸、杏仁配伍應用在治療哮喘中的作用途徑和機制進行研究和探討，以期為日后進一步實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 中藥化學成分作用靶標及哮喘疾病相關靶標篩選

本研究中厚樸、杏仁的化學成分及靶標信息來自于中藥分子機制生物信息學分析平臺BATMAN-TCM[8](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。將收集整理后的靶點導入Uniprot數據庫[9](https://www.uniprot.org/)列表并限定物種為人，所有靶基因名稱校正為官方名稱(official gene symbol)，并剔除沒有靶點的活性成分。疾病靶標信息來源于PALM-IST數據庫[10](http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/)。

1.2 韋恩分析及潛在靶標信息篩選

應用Draw Venn Diagram在線工具[11](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對厚樸-杏仁(Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum)藥物靶標與哮喘疾病靶標進行韋恩分析。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網絡構建及可視化分析

采用string數據庫[12](https://string-db.org/cgi/input.pl)對收集到的藥物靶標構建蛋白質相互作用網絡(protein protein interaction network, PPI network)，設置物種為“Homo sapiens”，設定最小相互作用得分(interaction score)>0.4進行操作，隱藏離散靶點。利用Cytoscape v3.5.1軟件的在線工具Network Analyzer進行可視化參數設置，通過cetiscape 2.2插件進行連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)分析，篩選關鍵靶標信息。

1.4 基因功能和通路富集分析

利用DAVID (the database for annotation, visualization and integrated discovery)數據庫[13](https://david.ncifcrf.gov/)和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+cluepedia插件對藥物關鍵靶標進行GO(gene notology)生物功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集分析。

2 結果

2.1 厚樸-杏仁藥物靶標與疾病靶標檢測結果

通過BATMAN-TCM數據庫對厚樸、杏仁的化合物和靶標信息進行檢索，設置篩選標準Score cutoff大于等于40，P≤0.05，剔除不含靶標的化合物，分別找到厚樸、杏仁的化合物38個、16個；靶標353個、186個。剔除3個共有化合物及104個共有靶標，共收集到化合物51個(見表1)，靶標435個。通過PALM-IST數據庫對疾病的靶標信息進行檢索，以“asthma”作為搜索的關鍵詞，篩選標準為 No. of article大于10，共找到疾病相關靶標415個。

表1 厚樸-杏仁治療哮喘的藥物有效成分基本信息Table 1 Basic information of effective ingredients of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.2 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標篩選

將厚樸-杏仁靶點與疾病靶點信息輸入在線工具Draw Venn Diagram進行Venn分析，如圖1所示，其中兩組靶標重疊部分共有33個靶標，得到厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標，并用Uniprot數據庫校正靶標名稱和基因ID，如表2所示。

圖1 厚樸-杏仁靶標與疾病靶標venn分析Fig.1 Target of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination and disease target by the Venn analysis

表2 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標Table 2 Potential targets for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

續表2

2.3 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標PPI網絡構建

通過string數據庫，對上述33個厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標進行PPI網絡構建，其中“TYRP1”為離散靶點，以下分析中隱去。采用Cytoscape v3.5.1軟件的在線工具Network Analyzer進行可視化參數設置，通過cetiscape 2.2插件選取連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)并選擇“for Undirected Networks”進行分析，篩選出厚樸-杏仁治療哮喘的關鍵靶標14個，分別為ADRB2、CAT、ESR1、F2、IL13、IL1B、INS、MAPK1、PLG、PPARG、TLR4、TNF、TRPV1、VCAM1，如圖2所示。圖中靶標節點按degree值進行大小和顏色調節，節點越大顏色越深，表示degree值越高，其中黃色圓點為離散程度較大的靶標。degree值最高的靶標為腫瘤壞死因子(TNF)，Ying等[14]研究表明，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中的TNF mRNA增加，提示TNF在哮喘的發病機制中起作用。

圖2 厚樸-杏仁治療哮喘潛在靶標PPI網絡構建Fig.2 PPI network construction of the potential target for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.4 化合物-潛在靶標相互作用網絡構建

利用Cytoscape v3.5.1軟件對藥物有效成分和厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標進行化合物-潛在靶標相互作用網絡構建，如圖3所示。網絡圖中紅色圓形代表化合物，黃色橢圓形代表藥物潛在靶點，一個節點的度(degree)表示網絡中和節點相連的路線的條數，藍色線條代表化合物與靶點之間的網絡，紫色線條代表基因與基因之間的網絡。化合物中花生四烯酸(arachidic acid，AA)有最多的潛在靶標(10個)，研究表明，花生四烯酸的代謝產物半胱氨酸白三烯(cysteinyl leukotrienes，Cys LTs)和脂氧酸(lipoxins，LXs)的不平衡狀態在哮喘慢性炎癥狀態中起重要作用。

圖3 化合物-潛在靶標網絡圖Fig.3 The compound-potential target network

2.5 厚樸-杏仁治療哮喘關鍵靶標GO生物功能分析

利用DAVID數據庫和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+cluepedia插件對厚樸-杏仁治療哮喘的關鍵靶標進行GO功能分析，其中GO基因功能分析包括生物學過程(biological process，BP)、細胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3部分，并從P<0.05的分析結果中篩選信息。

2.5.1 厚樸-杏仁治療哮喘的生物學過程

厚樸-杏仁治療哮喘的生物學過程(biological process，BP)主要涉及應激反應調控、先天性免疫反應調控、防御反應、急性炎癥反應、刺激反應、凝血止血調節、自我內穩定、活性氧代謝過程、細胞死亡調控、細胞增殖、信號轉導、細胞通訊、創傷修復、趨化因子產生、蛋白質代謝過程等生物過程，如表3所示。

表3 厚樸-杏仁治療哮喘的生物學過程Table 3 Biological process of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.2 厚樸-杏仁治療哮喘的細胞定位

厚樸-杏仁治療哮喘的細胞定位(cellular component，CC)主要涉及胞外區及細胞外空隙，具體如表4所示。

表4 厚樸-杏仁治療哮喘的細胞定位Table 4 Cellular component of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.3 厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能

厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能(molecular function，MF)主要涉及信號傳感器活性、信號受體活性、受體活性、分子傳感器活性、RNA聚合酶II轉錄因子活性，配體活化的序列特異性DNA結合及轉錄因子活性，直接配體調控序列特異性DNA結合等，如表5所示。

表5 厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能Table 5 Molecular function of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.6 厚樸-杏仁治療哮喘關鍵靶標KEGG信號通路富集分析

利用DAVID數據庫和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+Cluepedia插件對厚樸-杏仁治療哮喘的關鍵靶標進行KEGG信號通路富集分析，并從P<0.05的分析結果中篩選信息。

厚樸-杏仁治療哮喘的關鍵靶標主要涉及NF-κB信號通路、IL-17信號通路、FcεRI信號通路、Toll受體信號通路及FoxO信號通路等，如表6所示。

表6 厚樸-杏仁治療哮喘關鍵靶標KEGG信號通路Table 6 The KEGG signaling pathway of the key target of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

3 討論

哮喘是一種慢性呼吸系統疾病，涉及多種細胞及細胞組分，臨床表現以氣道的慢性炎癥、氣道重塑和氣道高反應為特征。盡管糖皮質激素和β2受體激動劑可有效控制哮喘癥狀，但長期使用容易出現副作用，因此仍缺乏治療哮喘的有效方法。目前，在亞洲使用了數千年的傳統中藥開始在西方醫療保障中作為一種補充和替代醫學的方式發揮作用，并且越來越多的證據表明中醫藥治療哮喘的科學性[15]。哮喘之名出自《丹溪心法·喘論》，屬于中醫“哮證”“喘證”范疇，其病機為宿痰伏于肺，復感外邪引動，使痰阻氣道、肺氣上逆而致痰鳴如吼，氣息喘促。厚樸-杏仁入藥歷史悠久，清朝汪昂《本草備藥》中云：“厚樸，苦降能瀉實滿，辛溫能散濕滿；杏仁，瀉肺、解肌、潤燥、下氣”，兩者配伍應用“瀉肺平喘，以降氣逆”。本研究的GO基因功能和KEGG信號通路分析結果顯示，厚樸-杏仁配伍可通過調節多種靶點、生物學途徑和信號通路，在哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應等方面發揮治療作用。

3.1 厚樸-杏仁治療哮喘具有調節多靶點、多途徑的潛在作用

(1)調控炎癥反應

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-13(IL-13)和白介素1β(IL1β)是引起哮喘氣道炎癥的重要介質。研究顯示，TNF-α能夠增強IL-23調節的Th2和Th17細胞免疫應答[16]，IL-13能夠刺激B細胞的增殖、分化及IgE的合成，與肥大細胞、嗜酸性細胞相互作用，誘發哮喘的急性發作[17]，IL1β參與嗜酸性粒細胞的炎癥過程[18]。這些介質協同作用于氣道，引起多種炎癥細胞的募集活化，促進氣道黏液產生和平滑肌收縮，引起氣道重塑和氣道高反應。

(2)調控活性氧代謝

氧化應激損傷參與哮喘的發生發展過程，能夠上調Th2細胞介導的炎癥反應，增加哮喘的嚴重程度，促進氣道高反應和氣道重塑。過氧化氫酶(CAT)是一種重要的抗氧化酶，其遺傳變異可通過促進細胞對抗活性氧，影響哮喘的發生過程[19]。

(3)調控信號轉導

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是機體普遍表達的信號轉導酶，幾乎涉及哮喘炎癥網絡的所有方面，MAPK信號激活后能夠加速細胞外信號傳到細胞核內，促進炎性細胞因子生成，從而導致氣道炎癥[20]。

(4)調控受體活性

本研究的關鍵靶標中多種受體參與哮喘的發生。β2腎上腺素能受體(ADRB2)是G蛋白偶聯腎上腺素受體家族成員之一，其基因的多態性與哮喘的易感性、哮喘惡化等方面具有相關性[21]。雌激素受體(ESR1)可能會導致哮喘患者的肺功能下降，尤其女性哮喘患者在月經期會出現哮喘癥狀加重[22]。胰島素(INS)抵抗在肥胖相關的哮喘急性發作中起作用，可能與胰島素信號受損，影響葡萄糖的攝入，從而影響抵抗細菌感染的氣道代謝屏障有關[23]。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)是一種涉及多種細胞過程的配體激活轉錄因子，能夠調節哮喘小鼠的氣道高反應、炎癥、細胞因子表達和組織重塑[24]。瞬時受體潛在陽離子通道亞家族V成員1(TRPV1)是調節CD4+細胞的激活和炎癥特性重要介質，TRPV1抑制劑可減輕IL-13誘導的哮喘小鼠氣道上皮損傷，從而降低哮喘特征[25-26]。激活的Toll樣受體4(TLR4)可以直接或間接影響調節性T細胞的功能，從而影響Th1/Th2失衡，其基因多態性與哮喘的嚴重程度有關[27]。

(5)調控凝血止血功能

氣道的慢性炎癥可導致血管內皮細胞損傷，激活血小板和凝血因子，導致凝血功能紊亂。IL-6和較小程度的TNF-α介導的全身性炎癥狀態，可以驅動血漿中凝血酶原激活片段F1+2(F2)產生增強[28]。纖溶酶原(PLG)在炎性細胞遷移中起關鍵作用，參與哮喘早期支氣管周圍區域的膠原沉積和黏液化生，與組織重塑有關[29]。

3.2 厚樸-杏仁治療哮喘具有調節多通路的潛在作用

(1)厚樸-杏仁具有調節FcεRI和NF-κB信號通路的潛在作用

肥大細胞介導的Ⅰ型過敏反應可導致哮喘的發生，抗原與IgE介導的FcεRI復合物交聯激活肥大細胞，釋放過敏介質及產生各種細胞因子(TNF-α、IL-1β等)，觸發細胞內信號級聯反應[30〗。NF-κB是FcεRI信號級聯反應中的一個關鍵的轉錄因子，涉及多種炎癥反應，通過調節細胞因子、趨化因子和細胞黏附分子的表達在氣道病理學中起重要作用[31]。

(2)厚樸-杏仁具有調節Toll受體和IL-17信號通路的潛在作用

Toll樣受體是介導免疫系統識別病原體的受體家族，病原體通過Toll樣受體激活氣道上皮的先天性免疫反應，并誘發氣道炎癥，從而導致哮喘急性加重。IL-17在哮喘小鼠模型中高表達，參與哮喘的氣道炎癥和氧化應激過程[32]。研究表明，IL-17A和TLR3通過TLR3/TRIF介導的NF-κB/IRF3激活，協同誘導上皮細胞中促炎因子和趨化因子的表達[33]。

(3)厚樸-杏仁可能具有調節FoxO信號通路的潛在作用

FoxO是一類對氧化還原敏感的重要轉錄因子，參與細胞周期調控、凋亡、氧化應激抵抗等生物學過程，但目前有關其在哮喘作用中的研究較少，可能與哮喘的氧化應激損傷相關。

氣道的慢性炎癥是導致哮喘發生的關鍵，這種慢性炎癥對氣道的損害進一步引起氣道高反應和氣道重塑，以上靶點和通路在哮喘氣道炎癥發病機制中起重要作用，也是厚樸-杏仁發揮治療作用的關鍵。因此，厚樸-杏仁治療哮喘具有多靶點、多途徑、多通路的潛在作用。本研究基于網絡藥理學方法在一定程度上揭示了中醫藥治療哮喘的科學內涵，但尚缺乏實驗驗證，可作為進一步實驗研究的依據。