基于高通量靶向測(cè)序的大鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)方案建立

徐園，錢(qián)強(qiáng)，鮑世民，肖君華，李凱*

（1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 2016202；2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，上海 200031）

近交系與封閉群大鼠作為重要的動(dòng)物模型，在臨床前藥物實(shí)驗(yàn)、毒理實(shí)驗(yàn)等科研工作中起著愈來(lái)愈重要的作用[1]。但是大鼠經(jīng)過(guò)多年繁育，群間遺傳分化嚴(yán)重，使試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性大大降低，急需對(duì)大鼠建立遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)遺傳監(jiān)測(cè)手段保持其遺傳穩(wěn)定性[2]。商海濤等[3]用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析北京和上海兩家單位的Wistar和SD大鼠，結(jié)果表明各群體的遺傳多樣性保持良好，但群間遺傳差距較大。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的研究較多，而對(duì)大鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)研究較少。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)方法主要是以近交系小鼠和大鼠為基礎(chǔ)建立起來(lái)的，常用的方法主要包括毛色基因檢測(cè)法、生化標(biāo)記基因檢測(cè)法、免疫標(biāo)記基因檢測(cè)法、下頜骨形態(tài)測(cè)量分析法以及分子標(biāo)記檢測(cè)法[4]。傳統(tǒng)方法的操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且耗費(fèi)大量的人力物力，亟待找到一種簡(jiǎn)便、快速且價(jià)格低廉的方法來(lái)滿足目前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳品質(zhì)越來(lái)越高的要求。

基于多重PCR的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型方案，是一種高通量與高特異性的SNP分型方案[5]。本研究在PCR-LDR（連接酶檢測(cè)反應(yīng)）技術(shù)的SNP分型方案用于小鼠遺傳鑒定的基礎(chǔ)上[6]，將同樣的方法運(yùn)用于大鼠，篩選出大鼠染色體上均勻分布的90個(gè)SNP位點(diǎn)，并采用靶向建庫(kù)測(cè)序技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)大鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)的高通量SNP分型方案。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取來(lái)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（SYXK（滬）2007-0005）SHR、WKY、GK、F344共 4個(gè)近交系及SD封閉群大鼠，數(shù)量分別為9只、7只、4只、8只和7只，共35只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。收集這些大鼠尾巴1 cm左右，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和試劑

A-100 PCR儀，購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Gene Amp PCR system 9600 PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Norwalk公司；JY600+電泳儀，購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FR-200A全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置、生物電泳圖像分析系統(tǒng)，均購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司。

PCR引物（PAGE純化）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；dNTP（promega）購(gòu)自上海有漁生物工程有限公司；Taq酶體系和ddH2O為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 SNP位點(diǎn)選取

如圖1所示，挑選的SNP分布于所有的常染色體與X染色體上，每條染色體所含SNP最少為4個(gè)，最多為9個(gè)。Y染色體因?yàn)樾坌源笫螵?dú)有，且多樣性低，故未選擇。

1.4 DNA提取

DNA提取采用TianGEN（天根生化科技有限公司）組織基因組抽提試劑盒，操作步驟依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。吸取1 mL抽提好的DNA，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)其濃度，然后將所有的DNA樣本標(biāo)化到濃度為30 ng/mL，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 所選取SNP位點(diǎn)在大鼠基因組上的分布

1.5 引物設(shè)計(jì)

引物用Primer3在線軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）設(shè)計(jì)[21]，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小在200～250 bp，引物長(zhǎng)度為20～30 bp，熔解溫度（Tm）為55～65 ℃，GC含量為20%～80%。為了區(qū)分不同的樣品，設(shè)計(jì)了96對(duì)含有索引序列和通用序列的條形碼引物。最后使用Illumina公司的P5與P7引物，統(tǒng)一建庫(kù)。大鼠位點(diǎn)使用特異性引物見(jiàn)表1。

1.6 靶向SNP建庫(kù)和測(cè)序

建庫(kù)策略：第一輪PCR反應(yīng)以大鼠基因組DNA為模板，在兩端加上特異引物和接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪PCR擴(kuò)增使用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，使用與接頭匹配的通用引物，同時(shí)在引物兩端加上后續(xù)測(cè)序所需要的標(biāo)簽。PCR的測(cè)序策略如圖2所示。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化為95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 2 min，72 ℃ 30 s，進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)[7]。建庫(kù)產(chǎn)物送金唯智生物（蘇州金唯智生物科技有限公司，中國(guó)蘇州）進(jìn)行高通量測(cè)序，使用機(jī)型為illumina X-10，上機(jī)前產(chǎn)物經(jīng)安捷倫2100質(zhì)控。

1.7 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析和SNP的識(shí)別

所有的測(cè)序數(shù)據(jù)用FASTX-Toolkit[8]根據(jù)每一條序列的索引序列分配到不同的樣本中，再將索引序列和接頭序列用Cutadapt[9]軟件去除。所得到的干凈序列使用bwa[10]軟件和參考基因組比對(duì)得到sam格式的文件。所得的sam格式文件通過(guò)samtools[11]軟件得到mpileup文件，然后生成最終報(bào)告。對(duì)于SNP的檢出，過(guò)濾小于15×測(cè)序深度位點(diǎn)，雜合子判定標(biāo)準(zhǔn)為等位基因的序列讀長(zhǎng)比例在20%～80%。

表1 大鼠位點(diǎn)使用特異性引物

圖2 兩步法Hi-SNP建庫(kù)流程

圖3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程

2 結(jié)果與討論

2.1 擴(kuò)增子均一性

樣本均一性對(duì)于靶向重測(cè)序是非常重要的性能指標(biāo)，這將決定在平均測(cè)序深度下的SNP測(cè)定率。在這批樣本中總擴(kuò)增子數(shù)量4 205個(gè)，根據(jù)SNP鑒定時(shí)，有效深度大于等于15×，其中有3 607個(gè)擴(kuò)增子獲得有效覆蓋度，即有效擴(kuò)增子的數(shù)量為85.8%，深度的平均值為446×，深度的中值為229×。本批樣本85.8%的擴(kuò)增子最后獲得SNP數(shù)據(jù)（圖4）。

隨后，每個(gè)擴(kuò)增子深度對(duì)平均深度進(jìn)行了歸一化，如此則可直接觀察到平均測(cè)序深度對(duì)每個(gè)擴(kuò)增子的影響，即可評(píng)價(jià)總體均一度。從圖5可以看出，大部分的數(shù)據(jù)分布于平均深度的10倍范圍以內(nèi)，有較高的總體均一度，從而使總體測(cè)序量得以降低。

圖4 大鼠擴(kuò)增子測(cè)序深度

圖5 擴(kuò)增子相對(duì)深度累計(jì)曲線

2.2 Hi-SNP特異性

從圖6可以明顯看出，測(cè)序深度的增加，使得雜合子二等位基因比例向1∶1靠攏，而純合子的非特異等位基因數(shù)目比例則下降，即有效測(cè)序深度的增加有利于提高SNP的準(zhǔn)確性。

圖6 SNP位點(diǎn)等位基因比例

如圖7所示，從各品系大鼠SNP等位基因所在reads比例來(lái)看，該批次F344大鼠、GK大鼠、SHR大鼠和WKY大鼠絕大部分樣本為純合子，為近交系大鼠，符合遺傳質(zhì)量檢測(cè)的要求。雜合子絕大部分來(lái)源于SD大鼠，為封閉群大鼠。

圖7 各品系大鼠SNP位點(diǎn)等位基因reads比例

2.3 SNP位點(diǎn)在品系間的差異分析

運(yùn)用mega軟件，采用極大似然法查看各品系大鼠之間的遺傳距離。各品系大鼠，除SD大鼠，基本上聚集在一起。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)SHR大鼠和WKY大鼠與其他品系大鼠有較大的差異。

圖8 各大鼠運(yùn)用極大似然法構(gòu)建的聚類(lèi)圖

多重PCR靶向二代測(cè)序SNP分型方法相比于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)以及生物化學(xué)方法有著明顯優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在通量大、建庫(kù)方便、測(cè)序深度高、性價(jià)比高、特異性強(qiáng)、分辨率高和價(jià)格低廉等方面。

高通量二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，也使大規(guī)模樣本的基因組目標(biāo)區(qū)域及候選基因區(qū)域的測(cè)序成為可能。由此而建立的基于高通量測(cè)序的SNP分型技術(shù)，即是利用多重PCR，獲得含有目的的SNP位點(diǎn)基因組片段，定量混合后測(cè)序。相較于傳統(tǒng)的PCR-RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)）、PCR-SSCP（聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析），直接測(cè)序和基因芯片等SNP分型方法，具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）針對(duì)性強(qiáng)，目標(biāo)區(qū)域測(cè)序更有針對(duì)性，可以依賴大量的前期研究成果，獲得候選染色體區(qū)域片段；（2）信息量大，目標(biāo)區(qū)域測(cè)序可以完整覆蓋整個(gè)基因區(qū)域，不僅可以獲得高頻SNP的分型數(shù)據(jù)，還可以發(fā)現(xiàn)低頻的和個(gè)體特有的變異；（3）費(fèi)用低，多重PCR是一種高效、高產(chǎn)率的目標(biāo)DNA富集技術(shù)，比起液相雜交，Long PCR擴(kuò)增等富集技術(shù)，能提高富集效率，加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，結(jié)合高通量測(cè)序，同時(shí)可對(duì)數(shù)百個(gè)樣本進(jìn)行快速測(cè)序，大大降低了研究成本。

3 結(jié)論

鑒于國(guó)內(nèi)應(yīng)用SNP標(biāo)記分析通量相對(duì)較低，且尚未建立針對(duì)我國(guó)常用大鼠進(jìn)行系統(tǒng)而有效遺傳檢測(cè)的高通量SNP位點(diǎn)組合（SNPpanel）、SNP遺傳檢測(cè)的方法及判定標(biāo)準(zhǔn)上的現(xiàn)狀，本研究通過(guò)高通量多重PCR技術(shù)聯(lián)合二代測(cè)序，優(yōu)化出一套可用于大鼠品系遺傳質(zhì)量快速檢測(cè)的高通量SNP鑒定方法，并易于標(biāo)準(zhǔn)化流程，有利于提高我國(guó)大鼠遺傳質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。