龐盼盼

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；上海生物芯片有限公司，上海 201203）

隨著基因芯片、高通量二代測序等技術(shù)的迭代更新，科學(xué)家們從不同物種內(nèi)鑒定發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA（noncoding RNA，NcRNA）目錄也越來越豐富[1]，人類基因組中可轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA的部分遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)編碼基因的部分，長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）[2]是其中非常重要的一員，通常長度超過200個(gè)堿基且不翻譯成蛋白質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在細(xì)胞的不同層面中調(diào)控發(fā)育和病變等多種生物學(xué)進(jìn)程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控、蛋白質(zhì)或RNA分子的調(diào)控[3-4]。除了根據(jù)lncRNA長度、轉(zhuǎn)錄特性分類，lncRNA還可以根據(jù)lncRNA位點(diǎn)含有的特殊DNA調(diào)控元件分類，有增強(qiáng)子lncRNA、啟動子相關(guān)ncRNA、3′-UTR相關(guān)RNA 等[5]。

本文通過定制基因芯片和可獲取的公共數(shù)據(jù)庫，在芯片中鑒定出14213個(gè)超級增強(qiáng)子相關(guān)lncRNA（super enhancer-associated lncRNA，SE-lncRNA）；進(jìn)一步篩選得到292個(gè)在前列腺癌中差異表達(dá)的SE-lncRNA。熒光定量PCR驗(yàn)證部分潛在調(diào)控SE-lncRNA及編碼基因，結(jié)果與芯片完全吻合。結(jié)合生物信息學(xué)手段，通過對超級增強(qiáng)子及其靶基因啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析，構(gòu)建了一個(gè)SE-lncRNA-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

總RNA核酸抽提試劑盒（#217004）、DNA酶消化試劑盒（#79254）、R核酸純化試劑盒（#74106），QIAGEN公司；安捷倫RNA質(zhì)檢膠條（#5067-5576）、安捷倫RNA質(zhì)檢緩沖液（#5067-5577）、低起始量全轉(zhuǎn)錄組單標(biāo)試劑盒（#5190-2943）、標(biāo)準(zhǔn)品Spike-In（#5188-5282）、表達(dá)譜芯片雜交試劑盒（#5188-5242）和表達(dá)譜芯片洗滌試劑盒（#5188-5327），Agilent公司；無核酸酶水（#AM9937）、組織保存液（#AM7021），Ambion公司；無水乙醇（#A500737），SangonBiotech公司；氯仿（#0757-500 mL），Amresco公司；高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#FSQ-101），TOYOBO公司；SYBRGreen熒光定量試劑盒（#4367659），ABI公司；TRIzol裂解液（#15596026），美國ThermoFisher公司；DEPC焦碳酸二乙酯（#B600154 ），上海生工生物工程股份有限公司；RNeasy mini Kit核酸純化試劑盒（#74106），德國QIAGEN公司。

1.2 樣本

3例前列腺癌患者的腫瘤組織及配對正常癌旁組織，手術(shù)所取樣本立即裝入含組織保存液的凍存管中，樣本管在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，然后轉(zhuǎn)移到-20 ℃存貯。

1.3 抽提

前列腺癌組織的RNA提取。（1）將小塊組織用手術(shù)刀片切成薄片，置于1.5 mL離心管中，加入300 μL TRIzol，將離心管置于冰上，用組織研磨器對組織進(jìn)行充分研磨，按照研磨30 s、冷卻30 s的研磨頻率進(jìn)行。（2）研磨之后按照細(xì)胞RNA提取方法進(jìn)行RNA的抽提，裂解液置于冰上充分裂解細(xì)胞5 min后，加200 μL氯仿，震蕩混勻30 s，室溫放置5 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相到新的離心管中。加入500 μL異丙醇，顛倒混勻多次，-20 ℃靜置10 min（為了提升提取效率可放置1～2 h），4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清，加1 mL 75%的乙醇清洗殘留的有機(jī)溶液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。小心吸除上清液，保留RNA沉淀。空氣干燥10～15 min。加適量DEPC處理過的水溶解，測OD260/OD280并計(jì)算RNA濃度。電泳檢測RNA的完整度。可置于-80 ℃長期保存，RNA應(yīng)盡快使用，避免反復(fù)凍融。

1.4 基因芯片制作

1.4.1 總RNA的擴(kuò)增與熒光標(biāo)記

應(yīng)用Agilent低起始量快速擴(kuò)增基因表達(dá)標(biāo)記試劑盒擴(kuò)增和標(biāo)記樣品的完整轉(zhuǎn)錄本。以提取的總RNA為模板，經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再經(jīng)Cy3熒光標(biāo)記獲得cRNA。

1.4.2 標(biāo)記效率質(zhì)檢

標(biāo)記后的cRNA經(jīng)RNeasy mini kit純化后，使用NanoDrop的微陣列檢測功能，通過cRNA（ng/μL）和Cy3（pmol/μL）濃度來計(jì)算熒光插入率。

1.4.3 芯片雜交、洗滌與掃描

應(yīng)用Agilent Gene Expression Hybridization Kit，取1.65 μg標(biāo)記后cRNA配制片段化和雜交反應(yīng)液。使用上海生物芯片有限公司的SBC Human ceRNA Array表達(dá)譜芯片，最終合成的芯片在滾動雜交爐中，65 ℃雜交17 h。雜交完成后取出芯片，應(yīng)用Gene Expression Wash Buffer Kit在洗缸中洗滌芯片。芯片經(jīng)洗滌后，“Agilent”面朝上放進(jìn)片夾，蓋上防臭氧的蓋子。立即掃描以最大限度降低臭氧影響，避光密封保存。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

cRNA的反轉(zhuǎn)錄按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，在0.2 mL PCR管中配制反應(yīng)溶液，體系如下：5×RTBuffer 2.0 μL、RTEnzyme Mix 0.5 μL、Primer Mix 0.5 μL、Ttoal RNA 1 μg，然后用RNase free H2O補(bǔ)足至總體積20 μL。振蕩混勻短暫離心后，置于PCR儀內(nèi)，設(shè)置溫度為37 ℃（15 min）、98 ℃（5 s）完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，4 ℃保存。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行SYBR Green qPCR實(shí)驗(yàn)，在0.2 mL PCR管中配制反應(yīng)液，體系如下：2×SYBR Green PCR buffer 10 μL、Forward primer（10 μmol/L）0.5 μL、Reverse primer（10 μmol/L）0.5 μL，Template 10 ng，然后用RNase free H2O補(bǔ)足至總體積20 μL。實(shí)時(shí)定量PCR儀器使用ABI7500，運(yùn)行程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線。每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，檢測結(jié)果取平均值。采用相對threshold cycle（△△Ct）方法計(jì)算相對表達(dá)水平，mRNA和lncRNA定量以β-actin作為內(nèi)參基因校準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前列腺癌相關(guān)SE-lncRNA鑒定

dbSUPER是最早的超級增強(qiáng)子數(shù)據(jù)庫，其利用ENCODE、GEO等公共數(shù)據(jù)庫中H3K27acCHIP-seq數(shù)據(jù)，先采用MACS識別增強(qiáng)子，再使用ROSE軟件鑒別出超級增強(qiáng)子，并補(bǔ)充了文獻(xiàn)報(bào)道的超級增強(qiáng)子。Super-Enhancer Archive數(shù)據(jù)庫在此基礎(chǔ)上有所補(bǔ)充。下載dbSUPER和Super-Enhancer Archive兩個(gè)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，并進(jìn)行整合獲得超級增強(qiáng)子庫。而SBClncRNA芯片收錄SE-lncRNA和mRNA較全面，整合了 NCBI、Genecode、Noncode、LNCipedia等多個(gè)數(shù)據(jù)庫。對前面獲得的超級增強(qiáng)子庫與芯片lncRNA進(jìn)行比對，鑒定出14 213條超級增強(qiáng)子RNA。進(jìn)一步利用SBClncRNA芯片，分析了3對前列腺癌患者的癌和癌旁樣本的lncRNA、SE-lncRNA和mRNA表達(dá)譜，利用PCA對樣本分組進(jìn)行評估，結(jié)果與生物學(xué)分組相符（圖1A和圖1B）。原始數(shù)據(jù)用R軟件中的limma包歸一化處理后，采用2倍Fold-change以及T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對差異基因進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)SE-lncRNA和mRNA。共鑒定到292個(gè)前列腺癌相關(guān)的差異表達(dá)SE-lncRNA和1 220個(gè)差異表達(dá)mRNA。差異表達(dá)SE-lncRNA和mRNA熱圖（圖1C和圖1D）、火山圖（圖1E）展示了芯片整體差異情況。對差異SE-lncRNA的長度和染色體位置進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，長度小于2 000 nt的差異SE-lncRNA占比為77.39%，而其在各染色體分布比較均一（圖1F和圖1G）。

2.2 SE-lncRNA靶基因預(yù)測及功能分析

雖然大多數(shù)SE-lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用尚不清楚，但其被認(rèn)為是功能活性增強(qiáng)子的標(biāo)志。有研究表明[6]，SE-lncRNA可能輔助超級增強(qiáng)子起到順式調(diào)控作用。為進(jìn)一步分析、預(yù)測SE-lncRNA潛在功能和機(jī)制，利用超級增強(qiáng)子在細(xì)胞中起到順式作用的原理，根據(jù)染色體物理位置關(guān)系將臨近基因作為顯著差異表達(dá)SE-lncRNA的靶基因。芯片同時(shí)設(shè)計(jì)了mRNA檢測探針，可以允許篩選SE-lncRNA靶基因的表達(dá)變化。SE-lncRNA及其靶基因共同差異變化且變化趨勢相同時(shí)，被認(rèn)為SE-lncRNA對其靶基因具有潛在順式調(diào)控作用。篩選到188個(gè)順式調(diào)控關(guān)系，這其中包含139個(gè)SE-lncRNA和155個(gè)靶基因。

目前認(rèn)為SE-lncRNA主要起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，那么其靶基因的功能也就能預(yù)測出SE-lncRNA可能的調(diào)控方向。接下來對差異SE-lncRNA靶基因進(jìn)行了GSEA富集分析，基于GSEAhallmarks數(shù)據(jù)集的通路分析結(jié)果顯示，主要激活了MYC靶基因、雄激素應(yīng)答、DNA修復(fù)、膽固醇動態(tài)平衡、氧化磷酸化、E2F靶基因、mTORC1信號通路和G2M檢查點(diǎn)等通路，抑制了凋亡、KRAS信號通路、組織缺氧、干擾素應(yīng)答和雌激素反應(yīng)延遲等通路。被激活和抑制富集程度最高的3個(gè)通路如圖2A～2F所示。利用Fisher精確檢驗(yàn)對差異SE-lncRNA靶基因進(jìn)行了GO富集分析，鑒定顯著富集功能894條，其中生物學(xué)過程相關(guān)691條，細(xì)胞成分相關(guān)119條，分子功能相關(guān)84條。顯著富集的40條通路如圖2G所示，主要涉及激素調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等。

圖1 前列腺癌種差異表達(dá)基因的篩選

2.3 SE-lncRNA與mRNA共表達(dá)分析

圖2 GSEA和GO分析預(yù)測SE-lncRNA靶基因的功能

SE-lncRNA除了能夠順式調(diào)控，也有文章報(bào)道其具有反式調(diào)控作用。為預(yù)測SE-lncRNA反式調(diào)控靶向基因，采用了共表達(dá)分析。共表達(dá)分析是根據(jù)SE-lncRNA及mRNA的信號值，通過共表達(dá)計(jì)算方法構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)幫助發(fā)現(xiàn)SE-lncRNA與mRNA之間可能存在的作用關(guān)系，篩選共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)正相關(guān)的關(guān)系對，能夠找到影響mRNA表達(dá)的SE-lncRNA（圖3）。通過分析共找到1 962個(gè)反式調(diào)控關(guān)系，節(jié)點(diǎn)連接數(shù)（degree）最高的5個(gè)SE-lncRNA為NONHSAT249416、ENST00000623545、NONHSAT118924、NONHSAT162106和ENST00000445427。

4.4 三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，預(yù)測SE-lncRNA調(diào)控機(jī)制

SE-lncRNA轉(zhuǎn)錄子超級增強(qiáng)子區(qū)域的功能很有可能是協(xié)助超級增強(qiáng)子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，采用Homer算法對JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif在SE-lncRNA轉(zhuǎn)錄子相關(guān)超級增強(qiáng)子和靶基因啟動子進(jìn)行預(yù)測，并篩選具有相同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif的SE-lncRNA-靶基因關(guān)系對，在這個(gè)關(guān)系對中SE-lncRNA可能協(xié)助其超級增強(qiáng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步構(gòu)建SE-lncRNA-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于從全轉(zhuǎn)錄組層面理解前列腺癌中SE-lncRNA參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4）。其中degree最高的5個(gè)SE-lncRNA為NR_038892、NONHSAT151931、NONHSAT108683、NONHSAT158683和 NR_003191。

4.5 qRT-PCR驗(yàn)證SE-lncRNA和mRNA

為了驗(yàn)證前期的發(fā)現(xiàn)，利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。挑選了 3個(gè) SE-lncRNA（ ENST00000431144、NONHSAT252076、ENST00000608741）和2個(gè)前列腺癌相關(guān)的編碼基因（AR、TNFAIP3）進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)顯示，qRT-PCR結(jié)果和芯片檢測的結(jié)果是一致的。NONHSAT252076和AR在芯片和qRT-PCR結(jié)果中均 為 上 調(diào)，ENST00000431144、ENST00000608741和TNFAIP3均為下調(diào)（圖5），這證明了前面結(jié)果的可靠性。

圖3 SE-lncRNA與mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 SE-lncRNA-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖5 前列腺癌差異表達(dá)lncRNA和mRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

通過對超級增強(qiáng)子和其靶基因啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析，如果他們具有相同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，這部分SE-lncRNA極有可能參與其相關(guān)增強(qiáng)子與靶基因啟動子空間構(gòu)象的維持，調(diào)控轉(zhuǎn)錄，并構(gòu)建了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。NR_038892是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中degree最高的SE-lncRNA，也是CBR3反義鏈的一個(gè)非編碼轉(zhuǎn)錄本，在此次研究結(jié)果中CBR3沒有顯著差異變化，其潛在顯著差異變化的靶基因包括順式靶基因DOPEY2和反式靶基因KLK12、RAB3D、BST1、PALD1，其中KLK12和BST1已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]和前列腺癌相關(guān)。為了證明芯片及數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果的可靠性，利用qRT-PCR驗(yàn)證部分潛在調(diào)控SE-lncRNA及編碼基因，結(jié)果與芯片完全吻合，這證明SE-lncRNA在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中確實(shí)起到了調(diào)控作用。

3 結(jié)語

本研究結(jié)果從新的角度認(rèn)識前列腺癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制，并為前列腺癌藥物開發(fā)、治療提供了潛在新靶點(diǎn)，具有非常重要的社會意義，為開創(chuàng)更精確、更有效治療前列腺癌的方法提供實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)依據(jù)。