營養缺陷型大腸桿菌高產L-蘇氨酸的研究

周泉錢，朱長俊，杜雨桐，羅奮杰，錢廣

（嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001）

蘇氨酸（Threonine）是一種重要的營養強化劑，有恢復人體疲勞、促進生長發育的效果。在醫藥上，由于蘇氨酸的結構中含有羥基，對人體皮膚具有保濕作用，在體內還能促進磷脂合成和脂肪酸氧化。目前，生產L-蘇氨酸的主要方法是大腸桿菌發酵法。草酰乙酸是L-蘇氨酸的前體，而大腸桿菌的草酰乙酸主要來源于三羧酸循環[1]，在此循環中天冬氨酰半醛（Aspartyl semialdehyde）和L-高絲氨酸（L-Homoserine）會分別生成副產物L-賴氨酸（L-Lysine）和L-甲硫氨酸（L-Methionine）。通過化學誘變后篩選出賴氨酸缺陷型大腸桿菌（Lys菌株）和賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型[2]大腸桿菌（Met-Lys菌株），該菌株的L-賴氨酸和L-甲硫氨酸支路途徑被阻斷，干路途徑的碳流量增加，從而使L-蘇氨酸的產量增加。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia coli），本實驗室保存。

試劑：按文獻[3-4]配制5%（V/V）的硫酸二乙酯乙醇溶液（DES）；pH=6.9磷酸緩沖鹽溶液（PBS）0.100 mol/L；25%（V/V）硫代硫酸鈉溶液；L-蘇氨酸標準溶液1.630×10-4mol/L；四氯對苯醌乙醇溶液3.000×10-3mol/L；硼砂溶液0.100 mol/L。

器材：UV-1100紫外分光光度計，濟南千司生物技術有限公司；SBA1243電子分析天平，哈爾濱德遠科技開發有限公司；Eppendorf 5810R離心機，深圳市德優平科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及培養基種類

保存菌種進行劃線分離，37 ℃恒溫倒置培養24 h。

培養基種類：種子培養基；基本培養基；二倍氮源高滲培養基；賴氨酸補充培養基；甲硫氨酸、賴氨酸補充培養基；大腸桿菌發酵培養基[5]。實驗流程圖如圖1所示。基本培養基、賴氨酸補充培養基及甲硫氨酸與賴氨酸補充培養基分別用MM、[Lys]、[Met、Lys]表示。

圖1 實驗流程圖

1.2.2 測定生長曲線及致死曲線

取15個150 mL錐形瓶，按計劃的培養時間長短分別編號為 0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、K（K為空白對照組，其余編號數字代表培養小時數）。每個錐形瓶中加入20 mL肉湯培養基，并按1%接種量接種0.2 mL種子液；K組和“0”組接種完成后立即于600 nm處測定吸光度并記錄數據，其余組37 ℃、180 r/min恒溫震蕩培養，相應時間到達后取出測定吸光度，處理數據并繪制生長曲線圖[6]。

取11組1.5 mL的EP管，分別添加不同量的5%DES（0～100 μL，以10 μL的量遞增），并用PBS定容至1.5 mL，誘變時長為15 min（從加入5% DES起到加入25%硫代硫酸鈉溶液終止），取1.0 mL處理液加入1.0 mL 25%（V/V）硫代硫酸鈉溶液終止誘變，然后各組取0.1 mL涂布于肉湯固體培養基上，3個平行，37 ℃倒置培養12 h，菌落計數，繪制致死曲線，計算公式如式1所示。

1.2.3 菌種誘變

Lys菌株的誘變：采用30 μL/mL菌懸液的比例進行誘變，誘變時長為15 min，誘變結束按照5%的接種量，移取2.5 mL處理液接種至50 mL[Lys]液體培養基中，37 ℃、180 r/min培養24 h，然后制成同體積的菌懸液。Met-Lys菌株的誘變過程同上，擴增培養的培養基改為50 mL[Met、Lys]液體培養基[7]。

1.2.4 篩選目標菌株

取0.1 mL經淘汰、純化后的菌懸液涂布于[Lys]平板，涂布6個平板；37 ℃倒置培養24 h。從[Lys]平板上挑取72個菌落，對應點植至MM平板和[Lys]平板上；經培養后挑取在[Lys]平板上生長情況比MM平板好的菌株作為疑似菌株。將其編號，進行復檢，分別在[Lys]平板和MM平板上進行劃線，連續培養5代，比較第5代的菌株在[Lys]平板與MM平板上的生長情況，若[Lys]平板上的菌株生長情況比MM平板的好，則說明該菌株是可以穩定遺傳的Lys菌株。

Met-Lys菌株的篩選：除涂布平板進行相應的變化，大致過程同上，獲得穩定遺傳的Met-Lys菌株。

1.2.5 發酵及L-蘇氨酸產量的測定

按照5%的接種量分別將普通大腸桿菌、賴氨酸缺陷型和賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型大腸桿菌的菌懸液接入20 mL發酵培養基中，每組3瓶，37 ℃、180 r/min培養48 h[8-9]。發酵結束后，將發酵液4 000 r/min離心20 min，取上清液稀釋500倍，準確移取1.0 mL稀釋液置于10 mL容量瓶中，加0.5 mL硼砂溶液（0.100 mol/L）和1.5 mL四氯苯醌溶液（0.003 mol/L），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，置50 ℃水浴40 min，水流冷卻至室溫，以相同方法制備試劑空白為參比，石英比色皿在352 nm處測吸光度A，求出L-蘇氨酸的含量[10-12]。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌生長曲線和5% DES致死曲線的測定

由圖2可知，實驗室保存大腸桿菌在2 h內生長緩慢，2～6 h為對數生長期。5% DES對大腸桿菌具有很強的致死作用，如圖3所示，添加量為30 μL時，致死率達到71.03%；添加量為50 μL時，致死率接近100%。在菌種的DES誘變過程中，要求致死率為70%～80%是最佳的誘變條件，因此，選取30 μL作為5% DES的添加量，進行大腸桿菌的菌種誘變。

圖2 大腸桿菌生長曲線圖

2.2 營養缺陷型菌株的篩選

根據不同平板上菌落的生長情況可以初步篩選出疑似Lys菌株和Met-Lys菌株，然后進行下一步檢測，初篩結果如圖4所示。圈出的菌落在第2排的平板上的生長情況均比第1排的平板要好，因此可知圈出的菌落為疑似營養缺陷型菌株。

圖3 大腸桿菌5% DES致死曲線圖

圖4 營養缺陷型菌株的初篩結果

2.3 營養缺陷型菌株的復檢

如圖5所示，通過比較不同平板上疑似菌株的生長情況，可以發現營養缺陷型菌株在營養補充型培養基上的生長情況比MM培養基上要好的多，由此便可以確認篩選出了營養缺陷型菌株。

圖5 營養缺陷型菌株的復檢結果

表1 營養缺陷型菌株與普通大腸桿菌菌株的L-蘇氨酸產量

2.4 營養缺陷型菌株穩定性檢測

連續培養5代后，可以發現Lys菌株和Met-Lys菌株都能較好地穩定遺傳。

2.5 L-蘇氨酸產量測定

如表1所示，Lys菌株的L-蘇氨酸產量比普通大腸桿菌增加了26.01%，達到了4.07 g/L；Met-Lys菌株比普通菌株增加了299.38%，達到了12.90 g/L。結合胡丹等人[13]的研究發現，此次誘變出來的Met-Lys菌株比其使用的工程菌L-蘇氨酸的產量（1.80 g/L）提高了6.17倍。

3 結論

賴氨酸缺陷型大腸桿菌和賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型大腸桿菌均可以有效提高L-蘇氨酸的產量，賴氨酸缺陷型大腸桿菌的L-蘇氨酸產量比普通大腸桿菌增加了26.01%；賴氨酸、甲硫氨酸雙重缺陷型大腸桿菌比普通大腸桿菌增加了299.38%。雖然選育出的單一營養缺陷型的突變株可以有效提高L-蘇氨酸的產量，但是與雙重突變株相比仍然存在一定的差距。本實驗僅是通過化學誘變選育了雙重營養缺陷型突變株，從而提高L-蘇氨酸產量。接下來的研究可通過改變發酵條件或是加快L-蘇氨酸的胞外分泌速度減弱L-蘇氨酸反饋抑制，來進一步提高L-蘇氨酸的產量。