BALB/c裸鼠與BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的比較

嚴朗，侍雯婧，田逸君，張吉芊竹，陳基快

（中國人民解放軍海軍軍醫大學海軍醫學系衛生毒理學教研室，上海 200433）

小鼠是目前最為常用的實驗動物，其中的免疫缺陷小鼠，如BALB/c裸鼠和重癥聯合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠廣泛應用于人類腫瘤研究中[1]。BALB/c裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，由于第Ⅷ連鎖群內裸體位點基因發生純合而形成，其特點是T細胞免疫功能缺陷，無接觸敏感性和移植排斥反應，廣泛用于免疫學、腫瘤學和疾病發生機理的研究[2]。已有不少研究表明BALB/c裸鼠T細胞明顯減少或缺失，B淋巴細胞正常，但功能欠正常，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG[3]。然而BALB/c裸鼠的巨噬細胞吞噬功能尚不明確。

巨噬細胞是參與體內組織防御的一群重要的免疫細胞，一方面可以利用吞噬作用來清除外來病原體和自身細胞碎片，另一方面可以激發獲得性免疫反應[4]。傳統觀點認為，巨噬細胞作為機體固有免疫細胞，具有抑制腫瘤生長的作用。但是最近研究表明，參與構成腫瘤微環境的巨噬細胞（Tumor-associated macrophage，TAM）具有促進腫瘤生長、侵襲、轉移和耐藥等作用[5]。BALB/c裸鼠作為腫瘤研究的重要工具鼠，明確其巨噬細胞的功能對于腫瘤發生發展、干預與預防研究至關重要。

本研究通過比較BALB/c裸鼠及野生型BALB/c小鼠兩種不同品系的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，探討兩種不同小鼠巨噬細胞的功能，為后續裸鼠荷瘤實驗結果分析提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雄性6周齡SPF級BALB/c裸鼠和BALB/c小鼠各6只，體重18～20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2017-0005]，飼養于海軍軍醫大學實驗動物中心SPF動物房[SYXK（滬）2017-0004]。所有小鼠飼養于12 h/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合海軍軍醫大學實驗動物倫理學要求（審批號：20180056）。

1.2 試劑與儀器

牛血清白蛋白BSA（上海生工生物有限公司，B600036-0250），RPMI1640培養基（Hyclone，SH30256.01），胎牛血清（Gibco，10099-141），磷酸緩沖液PBS（Hyclone，SH30256.01），青霉素、鏈霉素（Gibco，15140-122），巰基乙醇酸鈉（Merck，1.08191.0500）；FITC RAT IgG2a，Ctrl（400505），FITC F4/80（123107），? Red ；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，IX71），流式細胞儀（美國Beckman，CytoFLEX），小動物麻醉機（上海玉研科學儀器有限公司，ABS型），多功能酶標儀（美國Molecular Devices，SpectraMaxM2e）。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞提取和培養

在實驗前3天每天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉（2 mL/只），用異氟烷麻醉小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡1～2 min后在超凈臺中暴露出腹膜，用移液器吸5 mL無菌PBS液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，吸取腹腔中液體入離心管內，4℃、1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復2次，加入完全培養液（90% RPMI1640培養基+10%FBS+1%雙抗）重懸。調整濃度至2×105個/mL，接種到6孔板中，每孔2 mL。5% CO2溫箱孵育4 h后，換液，并用RPMI1640培養基洗1～2次，棄去未貼壁細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。

1.3.2 巨噬細胞流式細胞術鑒定

吸掉培養基，PBS洗1次，利用細胞刮收集巨噬細胞，吹打均勻后將細胞懸液分為兩管，1號管為陰性對照，1∶300加入FITC RAT IgG2a,κisotype Ctrl，2號1∶300加入FITC anti-mouse F4/80抗體，避光、常溫標記30 min，然后用流式緩沖液洗2遍，再用1 mL流式緩沖液重懸并移入流式管中，進行流式細胞術鑒定。

1.3.3 巨噬細胞吞噬熒光微球能力檢測

取熒光微球與1%BSA以1∶100體積比混勻，濃度為5×106個/mL，37 ℃避光孵育30 min，超聲處理5 min，臨用前配。6孔板每個孔加入2 mL熒光微球，即1×107個/孔，96孔板每個孔加入100 μL，放入CO2培養箱中避光孵育1 h，棄上清，利用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，最后加入1 mL PBS。利用熒光顯微鏡拍照，96孔板用多功能酶標儀在500和585 nm波段下讀取熒光數值。同時，利用細胞刮收集細胞于上流式細胞儀檢測。

1.4 數據處理

采用SPSS 23軟件進行統計分析，計量資料以平均值±標準差表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 細胞形態學觀察結果

獲取的小鼠腹腔細胞在含RPIM1640培養液中培養24 h后，細胞在顯微鏡下觀察圖像如圖1所示。兩種小鼠來源腹腔巨噬細胞形態不均一，可呈棱形、短桿狀或橢圓形等，有偽足和突起，界限清楚，有鈍圓形突起。兩組間細胞密度肉眼未見明顯差異。

圖1 培養24 h后的腹腔巨噬細胞形態

2.2 腹腔巨噬細胞流式細胞術鑒定

流式細胞儀檢測結果如圖2所示，BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞中F4/80陽性細胞比例為65.7%，表明該方法可以獲得合適純度的巨噬細胞。

圖2 BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞F4/80陽性細胞純度流式檢測結果峰圖

2.3 巨噬細胞吞噬熒光微球實驗

利用熒光顯微鏡拍照可見紅色熒光點為巨噬細胞吞噬的熒光微球，圖3A可見BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞大量吞噬熒光微球，而BALB/c裸鼠來源巨噬細胞吞噬熒光微球顯著減少。圖3B為多功能酶標儀檢測讀數結果，同樣顯示BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞熒光讀數顯著大于BALB/c裸鼠來源巨噬細胞（P＜0.05），有顯著性差異。

用流式細胞術法比較兩種小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，結果如圖4所示，可見BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞平均熒光讀數顯著大于BALB/c裸鼠來源巨噬細胞，結果有顯著性差異（P＜0.05）。

BALB/c裸鼠為BALB/c帶nu基因的同源近交系。裸基因是八號染色體上的隱性突變基因。病原體進入宿主體內首先啟動固有免疫應答，巨噬細胞作為主要的固有免疫細胞，其吞噬作用在抗感染、抗腫瘤及免疫調節過程中發揮重要的作用[6]。研究表明，BALB/c裸鼠容易患病毒性肝炎和肺炎，提示BALB/c裸鼠巨噬細胞吞噬功能障礙[7]。因此對BALB/c裸鼠巨噬細胞的吞噬功能進行深入研究十分必要。

圖3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球功能檢測

圖4 流式細胞術檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球功能

巨噬細胞是具有多種功能的免疫細胞，其不僅在先天免疫中發揮重要作用，也是機體細胞免疫中的一類關鍵細胞。目前，體外培養巨噬細胞來源很多，包括骨髓巨噬細胞、外周血巨噬細胞、腹腔巨噬細胞和肺臟巨噬細胞等，分離方法也有貼壁法、免疫磁珠分選法等[8-9]。本研究選取預先腹腔注射巨噬細胞刺激劑后腹腔灌洗提取腹腔巨噬細胞。該方法簡單高效，提取巨噬細胞可滿足蛋白檢測、功能檢測等多種分析方法。F4/80是檢測巨噬細胞的常用膜表面標志，即表皮生長因子樣激素受體1，主要表達于骨髓來源的單核細胞和巨噬細胞，盡管其在一些內皮樣細胞和嗜酸性粒細胞中也有表達，但是目前F4/80是小鼠巨噬細胞公認的標志物。本實驗提取的巨噬細胞比例為65%左右，和文獻報道一致[10]。

巨噬細胞的吞噬作用是先天免疫中最基本的防御機制，與細胞胞吞作用密切相關。吞噬作用包括識別胞吞物、攝入和清除等復雜過程，與其表面存在的多種受體有關。之前研究對無胸腺小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能存在爭議。Vetvicka[11]等發現無胸腺小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能代償性增加，可能與巨噬細胞表面FcR和補體受體增加有關。但是Ramos-Zepeda等[12]發現無胸腺小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能與野生型相比并無變化。這可能與無胸腺小鼠的種系不同以及吞噬功能的檢測方法不同有關。此次研究發現BALB/c裸鼠吞噬熒光微球功能下降，并運用熒光顯微鏡、多功能酶標儀和流式細胞儀多種方法驗證。另外，巨噬細胞提取過程的區別也可能是結果不一致的原因。

3 結論

裸鼠和野生型小鼠作為動物模型廣泛應用于各種實驗中，比較兩種小鼠巨噬細胞吞噬作用有利于實驗動物模型的建立與創新，促進動物實驗向臨床應用轉化。本次研究結果表明，BALB/c裸鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能較BALB/c小鼠減弱，但是究竟那些基因改變影響裸鼠巨噬細胞吞噬功能還不明確，需要進一步的探索與研究。