高效液相色譜法測定不同品系亳白芍中4種化學(xué)成分含量

張騰騰，張夢嬌，王婉婷，居正，姬雨思，朱蝶

（亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽亳州 236800）

白芍始載于古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中[1]，亦別名為芍藥，來源于毛莨科植物芍藥（Paeonia lactitlora Pall.）的干燥根，其性苦、酸，微寒，歸肝和脾經(jīng)，是聞名的大宗中藥材，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛和平抑肝陽的功效[2]，古籍中曰其“益脾、能與土中瀉木”[3]。白芍的有效部位是白芍總苷，包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷及氧化芍藥苷等眾多的單萜糖苷類化合物，是白芍的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。現(xiàn)代藥理表明，白芍總苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎以及保肝等多種作用[5-6]。李馳[7]在研究亳白芍中化學(xué)成分時(shí)也提到，其含有的單萜糖苷類化合物有鎮(zhèn)痛、抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。

“亳白芍”是4大亳藥之一，為安徽省具有代表性的道地藥材之一。有學(xué)者認(rèn)為安徽的白芍栽培種質(zhì)混雜，需要加強(qiáng)對白芍資源的保護(hù)和利用，并從中發(fā)現(xiàn)優(yōu)異種質(zhì)，以利于白芍的生產(chǎn)發(fā)展和優(yōu)良品種的選育[8]。安徽亳州地區(qū)主栽白芍有“線條”“線蒲棒”“蒲棒”“馬扎子”“二糟”等多個(gè)品系，對各個(gè)品系中有效成分含量的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）對上述5個(gè)品系白芍的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷及苯甲酰芍藥苷4種有效成分進(jìn)行測定，為進(jìn)一步篩選出優(yōu)良品系、保持亳白芍的道地性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

“線條”“線蒲棒”“蒲棒”“馬扎子”“二糟”樣品于2019年采集于安徽亳州市大楊鎮(zhèn)。

1.2 儀器與試劑

LC-20AD高效液相色譜儀，島津；FA2104N分析天平，上海菁海儀器有限公司；XS105電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UH4150紫外可見近紅外分光光度計(jì)，HITACHI；DFY-400打粉機(jī)，溫嶺市大機(jī)械有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；DGT-G電熱鼓風(fēng)干燥箱，合肥華德利科學(xué)器材有限公司；JK-200DB超聲波清洗儀，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司。

苯甲酰芍藥苷對照品，批號19103002，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；氧化芍藥苷對照品，批號19053107，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；芍藥內(nèi)酯苷對照品，批號19011503，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；芍藥苷對照品，批號110736-201943，中國食品藥品檢定研究院。乙腈（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），色譜級；磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，優(yōu)級純；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），分析純；屈臣氏純凈水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18（0.46 cm×25 cm，5 μm）；流動相A為0.015%磷酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序?yàn)椋? min（92% A），5 min（88% A），17.5 min（87% A），20 min（86% A），38 min（80% A），48 min（70% A），63 min（40% A），73 min（92% A）；檢測波長258 nm（氧化芍藥苷），230 nm（其余3種成分）；柱溫30 ℃，流速 0.8 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 溶液制備

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱定芍藥內(nèi)酯苷2.36 mg，定容于10 mL容量瓶中；精密稱定氧化芍藥苷0.27 mg、苯甲酰芍藥苷0.46 mg、芍藥苷13.12 mg，分別定容于25 mL容量瓶中，加色譜級甲醇定容至刻度線處，搖勻，即得4種對照品貯備液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

稱取0.5 g白芍粉末（過80目篩）置于錐形瓶中，移取25 mL 50%乙醇溶液加入上述錐形瓶中，稱重，然后置于水浴鍋中加熱回流25 min后取出冷卻，補(bǔ)足減失重量，搖勻，用0.45 μm有機(jī)系濾頭過濾，取濾液。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密移取氧化芍藥苷對照品溶液0.1 mL、0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL，芍藥內(nèi)酯苷對照品溶液0.6 mL、1.1 mL、1.6 mL、2.1 mL、2.6 mL，芍藥苷對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，苯甲酰芍藥苷對照品溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇（色譜級）定容，搖勻后制成4種混合對照品溶液。在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣。以相應(yīng)對照品質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程。

1.3.3.2 精密度試驗(yàn)

吸取同一混合對照品溶液10.0 μL，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算4種化合物色譜峰峰面積的RSD值。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品，按照供試品溶液操作方式進(jìn)行處理。在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣12 h，每針間隔3 h，分別計(jì)算4種化合物色譜峰峰面積的RSD值。

1.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一樣品6份，分別按照“1.3.2”條件制成供試品溶液。在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，分別進(jìn)樣測定，記錄并計(jì)算4種化合物峰面積的RSD值。

1.3.3.5 加樣回收率

取已知含量的亳白芍樣品粉末5份，每份約0.25 g，精密稱定。按1∶1分別加入4種對照品適量，按“1.3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄相應(yīng)成分的色譜峰面積，計(jì)算回收率。

1.3.4 樣品含量測定

取“線條”“線蒲棒”“蒲棒”“馬扎子”“二糟”5個(gè)品系亳白芍，按照“1.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種有效成分色譜圖

白芍混合對照品中4種化學(xué)成分的出峰時(shí)間基本與亳白芍樣品中4種化學(xué)成分的出峰時(shí)間一致。

圖1 混合對照品與亳白芍樣品色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

在線性關(guān)系考察中，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷在其各自的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)分別是0.999 3、0.999 8、0.999 0、0.999 9，表明線性關(guān)系較好，其線性回歸方程如表1所示。

2.2.2 精密度

精密度實(shí)驗(yàn)中，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷面積的RSD分別為0.27%、0.32%、0.25%、0.27%，表明精密度良好。

表1 線性關(guān)系考察表

2.2.3 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷面積的RSD分別為0.31%、0.12%、0.10%、0.12%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷峰面積RSD分別為0.59%、0.80%、0.33%、0.12%，表明該法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率

在加樣回收率實(shí)驗(yàn)中，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷的平均回收率分別為100.75%、98.67%、98.11%、98.34%，從表2可以看出，該法回收率較好。

2.3 樣品含量

如表3所示，為不同品系亳白芍藥材中4種成分含量。若以芍藥苷含量為考察指標(biāo)，則5種品系含量由高到低依次為二糟＞線蒲棒＞蒲棒＞馬扎子＞線條；若以4種單萜苷總含量為考察指標(biāo)，則二糟＞線蒲棒＞馬扎子＞蒲棒＞線條。

表2 4種單萜苷成分的加樣回收率測定

表3 不同品系亳白芍藥材中4種成分含量

3 結(jié)論

不同品系亳白芍的4種單萜苷含量及總含量各不同，以芍藥苷含量和以四種單萜苷總含量為考察指標(biāo)時(shí)，五種品系中芍藥苷含量和四種單萜苷的總含量排名進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同品系亳白芍的排名存在部分差異，表明不同品種亳白芍質(zhì)量存在優(yōu)劣。