膿毒癥小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞miR-142-3p 的表達(dá)與其意義＊

陳海鳴 ，韋華璋 ，朱建光 ，熊啟安 ，鄧陶 ，溫志超 ，王聯(lián)群

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診外科，南昌 330006；2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，吉安 34300；3.安福縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，安福 34300；4.南昌大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南昌 330006；5.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南昌 330006）

全球每年膿毒癥患者數(shù)超過 1900 萬，其中有600 萬患者死亡，病死率超過 1/4，給全球的醫(yī)療衛(wèi)生帶來了巨大的負(fù)擔(dān)[1]。微小RNA（miRNA）是一種非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明， 某些miRNA 參與了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。miR-142 被認(rèn)為是T 細(xì)胞特異性miRNA， 在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的發(fā)育中起著重要的作用。我們分離膿毒癥小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞并檢測miR-142-3p 的表達(dá)水平，觀察其與相關(guān)炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組 采用野生型清潔級雄性C57BL/6 小鼠 28 只，6-8 周齡，體重(22±2)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，自由進(jìn)食、飲水，晝夜節(jié)律12h，環(huán)境溫度維持在26℃左右，濕度維持在40%-60%。 隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組、膿毒癥組，每組各14 只。本研究通過了醫(yī)院動物倫理委員會的審批。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建小鼠CLP 膿毒癥模型 2%水合氯醛溶液（15ml/kg）腹腔注射，麻醉成功后小鼠仰臥位固定，消毒，沿腹部正中線切開皮膚及腹膜，暴露盲腸，于盲腸根部至末端1/2 處使用3-0 號絲線結(jié)扎盲腸， 用22G 穿刺針從系膜緣向?qū)ο的ぞ壺灤┭阅c一次并擠出少量腸內(nèi)容物；還納盲腸，逐層縫合腹膜及皮膚， 術(shù)畢立即頸后皮下注射0.9%生理鹽水1ml 補(bǔ)液。 術(shù)后自由進(jìn)食飲水，保持室溫及濕度恒定。 假手術(shù)組小鼠在麻醉后僅開腹暴露盲腸后還納，隨后縫合腹膜及皮膚，頸后皮下補(bǔ)液。

1.2.2 免疫磁珠分選小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞 所有小鼠均于建模手術(shù)后48h 斷頸處死， 剪開腹部皮膚，留取脾臟，剪碎，取出脾臟，置于400 目濾網(wǎng)，研磨，收集細(xì)胞懸液，重懸后按1：1 滴淋巴細(xì)胞分離液 （ Ficoll-Hypaque 1.080， 天津川葉公司），離心， 小心吸取中間云霧層細(xì)胞獲取脾臟單個核細(xì)胞，通過MiniMACs 免疫磁性分離系統(tǒng)得到純化的CD4+T 細(xì)胞，吹打混勻，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆眠M(jìn)行PCR 檢測。

1.2.3 熒光實時定量（RT）-PCR 按miRneasy Mini試劑盒（德國QIAGEN 公司）說明書步驟，CD4+T細(xì)胞添加QIAZOL 溶液提取總RNA， 紫外分光光度計測定260nm（A260）的吸收值計算RNA 濃度，保證在 0.15-1.0。 按 miscript II RT Kit 說明，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，測定引物由QIAGEN 公司設(shè)計合成，以 Hs-RNU6-2（MS00033740）為內(nèi)參。 普通mRNA 按試劑盒（美國Thermo 公司）說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增35-50 個循環(huán)，取擴(kuò)增產(chǎn)物 10μl，2%瓊脂糖凝膠中，90V 電泳 30min，回收純化，并送交上海Invitrogen 公司測序，測序結(jié)果與GeneBank 中目的基因mRNA 序列完全一致。 根據(jù)Gene Bank 中基因mRNA 序列設(shè)計目的引物（由北京天根公司合成），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。 miR-142-3p 測定采用SYBR Green Kit（德國 QIAGEN 公司），每個反應(yīng)體系均為15μl，使用羅氏Light Cycler480Ⅱ熒光定量PCR 儀檢測其表達(dá)，每個反應(yīng)設(shè)3 個復(fù)孔，采用內(nèi)參進(jìn)行歸一化。具體操作參照說明書。待測因子表達(dá)應(yīng)用 Relative Quantification Soft ware Ver1.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 結(jié)果以目的基因/GAPDH 或U6比值表示。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血細(xì)胞因子 收集小鼠眼球血液樣本，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-2 表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 單因素分析中，采用卡方檢驗對計數(shù)資料進(jìn)行分析，采用t 檢驗對計量資料進(jìn)行分析，正態(tài)計量資料用（）表示，檢驗水準(zhǔn) a=0.05，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)膿毒癥模型構(gòu)建 建模后小鼠表現(xiàn)為：嗜睡，活動、攝食減少，目光呆滯，呼吸急促、嚴(yán)重者發(fā)紺，7d 生存率40%，中度膿毒癥模型構(gòu)建成功。

2.2 兩組miR-142-3p 及炎癥因子的表達(dá)水平比較 膿毒癥組miR-142-3p 較假手術(shù)組升高 （P<0.05）， 膿毒癥組 IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，差異有非常顯著意義（P<0.01）；IL-1β 和 IL-2 的表達(dá)水平亦較假手術(shù)組升高 （P<0.05），見表 1。

表1 miR-142-3p及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平（）

表1 miR-142-3p及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平（）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；**P<0.01

0.014 0.000 0.029 0.000 0.036指標(biāo) 膿毒癥組（n=14） 假手術(shù)組（n=14） t P miR-142-3p TNF-α IL-1β IL-6 IL-2 38.81±13.6*52.8±22.6**48.6±18.8*62.2±11.3**39.6±9.8 28.47±7.11 39.4±9.8 38.2±11.2 14.9±6.3 32.8±10.6 2.565 6.486 2.954 10.128 2.367

3 討論

雖然在過去數(shù)十年中， 膿毒癥的發(fā)病機(jī)制研究在病原微生物、細(xì)胞免疫學(xué)、病理生理學(xué)、基因/蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展， 然而膿毒癥免疫紊亂的致病機(jī)制仍未闡明[2-4]，其中CD4+T 細(xì)胞是細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的重要參與者， 其功能性分化是膿毒癥免疫功能紊亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

膿毒癥早期釋放的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化為促炎和抗炎細(xì)胞因子2 大類，促炎細(xì)胞因子主要包括TNF-α，IL-1，IL-6，IFN-γ 等， 其中 TNF-α 是炎癥早期最主要的促炎細(xì)胞因子， 也是內(nèi)毒素?fù)p傷效應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，IL-1 通過 IL-1β 表達(dá)并與 TNF-α 共同啟動炎癥反應(yīng)。 IL-6 是在IL-1 作用下產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，可作為膿毒癥嚴(yán)重程度的預(yù)測指標(biāo)[5,6]。 上述促炎細(xì)胞因子的釋放與膿毒癥炎癥的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。

微小 RNA（microRNA，miR）是一類長度約為22 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。 越來越多的研究證實， 某些特定的miR 已經(jīng)被報道參與了膿毒癥的免疫調(diào)控，并在診斷、治療以及預(yù)后中發(fā)揮著重要的精細(xì)調(diào)節(jié)作用[7,8]。miR-142 首先發(fā)現(xiàn)在老鼠的脾臟、胸腺表達(dá)，并T 細(xì)胞中表達(dá)特別高，對調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的發(fā)育起著重要作用。Moschos[9]發(fā)現(xiàn)小鼠肺脂多糖處理后，miR-142-3p 的表達(dá)上調(diào)，地塞米松預(yù)處理可抑制miR-142 的上調(diào)， 研究表明miR-142 可能與炎癥反應(yīng)相關(guān)， 參與了免疫應(yīng)答。Sun[10]檢測了8-12 周齡的小鼠樹突狀細(xì)胞體外LPS 刺激后分泌的細(xì)胞因子TNF-α、IL-10 和IL-12， 隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因組小鼠miR-142-3p 的過表達(dá)，TNF-α、IL-10 和 IL-12 的表達(dá)明顯增加，并減少了內(nèi)毒素引起的死亡率。

本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥小鼠模型[11]，穩(wěn)定的死亡率是衡量膿毒癥小鼠穩(wěn)定性的一個標(biāo)準(zhǔn)， 影響死亡率的主要因素是結(jié)扎長度和貫穿次數(shù)，穿孔直徑，一般結(jié)扎長度按照占盲腸總長度比例計算， 分為1/3、1/2 和全部盲腸結(jié)扎，根據(jù)以上比例分為輕度、 中度和重度膿毒癥模型，1周內(nèi)死亡率也分別約為30%、60%和90%。 本研究建模后小鼠表現(xiàn)為嗜睡，活動、攝食減少，目光呆滯，呼吸急促，嚴(yán)重者發(fā)紺，7d 生存率40%，表明中度膿毒癥模型構(gòu)建成功。 建模后48h 膿毒癥小鼠促炎細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β 和 IL-2 大量釋放，表達(dá)水平升高，尤其是TNF-α 和IL-6 升高顯著， 免疫磁珠分選獲得CD4+T 細(xì)胞miR-142-3p表達(dá)水平較假手術(shù)組水平升高， 與炎癥因子水平上調(diào)一致，與文獻(xiàn)報導(dǎo)一致，提示測定膿毒癥患者CD4+T 細(xì)胞miR-142-3p 的表達(dá)也可以作為判斷患者的感染炎癥指標(biāo)之一， 有助于膿毒癥的診斷和治療， 為膿毒癥的進(jìn)一步基因靶向治療提供了新的研究方向。