枸杞不同生長期多糖的理化特性及結構分析

張喜康，趙宇慧，劉 軍，李佩佩，馬 露，王 聰，王麗萍，劉敦華*

（寧夏大學農學院，食品質量與安全實驗室，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium）屬于茄科（Solanaceae）枸杞屬（LyciumL.）的落葉灌木植物[1]，研究表明枸杞具有豐富的營養價值，除了可以正常食用之外，在中藥中的使用時間長達幾個世紀，屬于中國傳統藥食同源的食物[2-3]。其中寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）是唯一被載入《中國藥典》的品種[4]。枸杞中含有多種生物活性成分，主要有多糖、類胡蘿卜素、類黃酮、甜菜堿等[5]，其中最主要的活性物質為枸杞多糖，是一種水溶性、以—O—連接的高分子糖蛋白[6]，大量研究表明，枸杞多糖可以補充腎臟和肝臟的陰虛[7-8]，抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等[9-11]，還參與免疫調節[12]、神經保護、輻射防護[13]等。

近年來，國內對枸杞多糖的研究多集中于測定枸杞干果粗多糖的含量、組成及解釋生理藥理功能和對枸杞粗多糖的活性評價，同時也取得了一定的成果。但關于枸杞在不同生長期的多糖動態研究最近幾年才有所增多，有關枸杞不同成熟期的枸杞多糖系統的理化特性和結構分析鮮見報道。房想[14]將不同生長期和成熟期的枸杞果實，即青果、黃果、頭茬果、普通夏果和秋果進行干制后，對多糖進行提取、純化，并測定含量和其單糖組成，結果顯示各個時期的多糖含量都是呈現先增加后降低的趨勢。朱彩平[15]對干燥的枸杞成熟果實的結構和生物活性進行了分析和評價，結果表明枸杞多糖中含有—COOH、—OH、—NH2，糖鏈中含有吡喃糖，有較長的側鏈和分支，不具有三股螺旋結構，且呈松散的碎片聚集狀態。

本研究將枸杞整個發育成熟期分為5 個階段，即幼果期、青果期、黃變初期、黃變后期、盛果期，所用枸杞樣品分別是采集這5 個階段的枸杞鮮果，經過多糖提取、除蛋白、純化得到提取率高且變化穩定的酸性多糖，再通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀、傅里葉紅外光譜儀、綜合熱力分析儀和掃描電子顯微鏡，分別測定各時期枸杞多糖的分子質量、單糖組成、糖鏈結構、熱力學性質和微觀結構。旨在為研究不同生長期枸杞多糖更深層次的生理特性以及超微結構提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從寧夏銀川市西夏區同心北街枸杞種植園采摘5 a生寧杞1號枸杞，從開花到成熟，根據枸杞的生理生長變化共分為5 個階段進行標記采樣，分別是幼果期（7 d）、青果期（14 d）、黃變初期（21 d）、黃變后期（28 d）、紅果期（35 d）。田間收集的樣品迅速放到液氮中，送回實驗室立即貯存至超低溫冰箱備用，樣品如圖1所示。

圖1 不同生長時期的枸杞Fig. 1 L. barbarum fruit at different growth stages

半乳糖醛酸（純度≥97%） 廣州市樂試生物科技有限公司；葡聚糖標準品（純度≥99%）、單糖標準品（純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BGZ-146電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司；JDG-0.2T真空冷凍干燥機 蘭州科近真空凍干技術有限公司；BT-50EA蠕動泵 重慶杰恒蠕動泵有限公司；TH-300梯度混合器、BSZ-100自動部份收集器 上海青浦滬西儀器廠；RE-52AA型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠；GCMS-QP2010 GC-MS聯用儀、LC-20A HPLC儀、RID-20A熒光檢測器 日本島津公司；JSM-7500F場發射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；SETARAM SETSYS16綜合熱分析儀 法國塞塔拉姆公司；Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；AR1500ex流變儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖理化測定

枸杞多糖的提取參考文獻[16]并稍作修改。Sevag法[17]脫蛋白，苯酚-硫酸法[18]測定枸杞多糖質量濃度，樣品溶液中枸杞粗多糖含量按下式計算：

式中：ρ為多糖質量濃度/（mg/mL）；d為稀釋倍數；V為溶液體積/mL；m為原料干物質/g。

硫酸-咔唑法[19]測定枸杞多糖中半乳糖醛酸含量，Bradford法[20]測定蛋白質含量。

1.3.2 枸杞多糖的分離與純化

DEAE-650M柱層析[21]對脫蛋白多糖進行分離，苯酚-硫酸法在490 nm和紫外分光光度法在280 nm波長處隔管測定多糖溶液的吸光度，繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線合并同一色譜峰洗脫液，脫鹽后冷凍干燥，得到初步純化后產品。

用葡聚糖凝膠色譜柱[22]對枸杞多糖進一步純化。苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定多糖溶液的吸光度，繪制洗脫曲線。合并同一色譜峰洗脫液，冷凍干燥。

1.3.3 不同生長期枸杞多糖結構分析

1.3.3.1 多糖分子質量測定

將各單糖標準品分別配成0.01 g/mL的標準溶液，枸杞多糖配成0.01 g/mL樣品溶液待用。色譜條件：流動相是水，流量1.0 mL/min，進樣量20 μL，色譜柱為Shodex 804HQ（300 mm×7.8 mm），柱溫30 ℃，Shodex RI-20A折光檢測器。

1.3.3.2 單糖組成分析

根據得到的多糖水解物[23]，采用三甲基硅烷化法衍生化單糖[24]，進行GC-MS[25]鑒定。

GC條件：HP-5 MS氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣量0.3 μL，分流比30∶1，延遲時間3 min，進口溫度230 ℃，檢測器溫度240 ℃，色譜柱采用程序升溫，起始溫度130 ℃，以3 ℃/min速率升至180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。

1.3.3.3 傅里葉紅外光譜分析

枸杞多糖樣品用KBr壓片，在4 000～400 cm－1區間內進行掃描[26]。

1.3.3.4 熱重分析

用綜合熱分析儀測定，加熱速率100 ℃/min，測試范圍30～800 ℃，得到微分掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）、熱重分析（thermogravimetric，TG）曲線[27]。

1.3.3.5 多糖掃描電子顯微鏡的測定

取多糖樣品粘于樣品臺上，置于離子濺射儀中鍍一層導電金膜后，采用場發射掃描電子顯微鏡觀察[28]。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 枸杞多糖的理化性質

2.1.1 枸杞不同生長期粗多糖含量測定結果

表1 枸杞在不同生長期粗多糖含量Table 1 Polysaccharide contents of L. barbarum fruit at different growth stages

由表1可知，在枸杞整個發育成熟過程中各個時期的粗多糖含量由大到小依次為21 d＞35 d＞14 d＞28 d＞7 d，變化范圍為34%～42%，整體呈現先增加后降低的趨勢。7 d的糖含量最低，與其他各時期均有顯著差異（P＜0.05），7 ～21 d的粗多糖含量一直持續緩慢增加，并在第21天達到峰值，在這之后又開始逐漸降低，且降低的幅度大于增加的幅度，生長期為28 d的粗多糖含量甚至接近7 d，到成熟期時又出現上升的趨勢，含量僅次于積累高峰期，差異性也表明，21 d和35 d的粗多糖含量與其他3 個時期有極顯著差異（P＜0.01）。出現這種趨勢的原因是幼果期枸杞質體中的多糖以淀粉形式存在，淀粉在枸杞整個發育成熟過程中的變化趨勢是先增加后降低，第14天時到達峰值，之后淀粉酶活性逐漸增強，淀粉顆粒大幅降解[29]，果實內部結構發生變化，但己糖逐漸被合成，所以枸杞多糖含量增幅較小，到達色變初期時，主要以能量代謝和糖代謝為主，所以此階段大量糖類物質積累，多糖含量達到峰值，色變后期果實顏色葉綠素降解，類胡蘿卜素和花青素積累，糖作為色素合成的前期原料被大幅降解，因此多糖含量降低，隨后果實內各種代謝產物被合成，轉化酶活性增強，將光合作用產生的蔗糖轉化成果糖和葡萄糖[30]，因此在成熟期時枸杞多糖含量又出現上升趨勢。

2.1.2 糖醛酸含量測定結果

表2 枸杞不同生長期糖醛酸含量Table 2 Uronic acid contents of L. barbarum fruit at different growth stages

糖醛酸是糖苷配基結合的糖醛酸苷形式或聚糖醛酸的形式成為果膠、半纖維素等細胞壁的主要成分，因此它的含量與果實質地有緊密的聯系。由表2可知，枸杞不同生長期糖醛酸質量濃度由高到低依次為14 d＞7 d＞21 d＞28 d＞35 d，變化范圍為3.0～5.5 mg/mL，整體呈現先增高后降低的趨勢。7～14 d糖醛酸含量緩慢增長，在第14天達到頂峰，之后又緩慢下降，21 d后出現快速下降的趨勢且色變初期之前的3 個階段與之后到成熟的兩個階段存在極顯著差異。青果期時，細胞間的黏著作用主要靠果膠維持，因此糖醛酸的含量會在第14天達到峰值，之后，隨著果實逐漸成熟，果膠脫酯降解，胞間膠黏作用降低，細胞壁結構崩塌，果實軟化，導致糖醛酸含量急劇下降[31]。

2.1.3 蛋白含量測定結果

表3 枸杞不同生長期蛋白含量Table 3 Protein contents of L. barbarum fruit at different growth stages

由表3可知，不同生長期的枸杞可溶性蛋白含量從大到小依次為28 d＞35 d＞21 d＞14 d＞7 d，增長趨勢與多糖和糖醛酸含量一致，只是蛋白含量在第28天達到峰值，之前一直是緩慢增加，達到峰值后降低。研究表明隨著枸杞果實成熟，基質聚糖會發生解聚，而擴展蛋白會使解聚速率增加，從而加速果實軟化，同時，輔助蛋白作為在生物質處理中潛在的輔助蛋白質膨脹素，通過降低纖維素的結晶度，也能促進果實軟化，因此蛋白含量在第28天達到最高，之后又降低[32]。

2.2 枸杞多糖的分離與純化

2.2.1 枸杞多糖的離子交換柱層析分離

圖2 DEAE-650M柱層析洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of polysaccharides from L. barbarum fruit at different growth stages by DEAE-650M column chromatography

分別用0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，以管數為橫坐標、以吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線，分別在280、490 nm波長處測其中蛋白質、多糖的洗脫情況，結果如圖2所示。

由圖2可知，經該柱層析分離蛋白和多糖均可得到3 個峰，說明它們均由3 種不同的組分構成，分別命名為1、2、3，其中多糖的峰形較蛋白對稱良好，蛋白的洗脫峰不是特別明顯，但依然可以看出5 個時期的蛋白和多糖幾乎在相同的位置出現峰，且峰的形狀相似，由此也可驗證前面的枸杞多糖是一種蛋白聚糖，也說明采用的梯度洗脫液能較好分離枸杞多糖。同時根據洗脫時的離子強度可知，40 管以前出現的組分1為中性多糖，以后出現的兩種多糖組分2、3均為酸性多糖。

2.2.2 枸杞多糖的凝膠柱層析分離

圖3 組分2的凝膠柱層析Fig. 3 Elution curves of component 2 by gel column chromatography

枸杞多糖是一種酸性雜多糖，由于組分3的提取率相對較低，結構分析效果差，且在枸杞整個發育階段變化不穩定，所以最后將組分2經過濃縮，脫鹽，凍干后進行凝膠層析柱純化（后面全是針對組分2展開實驗），如圖3所示。發現流出的曲線均呈單一對稱峰，說明已純化為相對分子質量均一的多糖組分。

2.3 多糖的結構分析

2.3.1 不同生長期枸杞多糖分子質量測定結果

結果測得各時期的分子質量依次為10.23、10.59、35.85、6.52 、6.43 kDa，大約分布在6～40 kDa之間，分子質量隨枸杞生長發育總體呈現先增高后降低的趨勢，起初從幼果期到青果期的增幅不大，到第21天，分子質量激增，并達到最高值，之后又急劇下降。

2.3.2 不同生長期枸杞多糖單糖組成分析結果

將各單糖標準品進行衍生化，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程。將多糖水解樣品和單糖混合標準硅烷化后進行GC-MS測定，單糖組成結果如圖4所示。

圖4 不同生長期枸杞多糖單糖組成物質的量比Fig. 4 Monosaccharide composition of polysaccharides from L. barbarum fruit at different growth stages

由圖4可以看到，各個時期7 種單糖的分布和變化情況，第14天這7 種單糖含量整體最高，其次是7 d，然后是35、21 d，含量最少的是在第28天，但28 d以甘露糖為主，且含量與7 d的持平，其中阿拉伯糖在7、14、21 d和35 d時期均占最大的比例，總體來說甘露糖、葡萄糖和核糖在各個時期含量均較小，從整個生長周期看，各單糖在升高至第14天時出現下降情況，第28天時又升高，基本遵循升高-降低-再升高的趨勢。

2.3.3 不同生長期枸杞多糖傅里葉紅外光譜測定結果

圖5 不同生長期枸杞多糖傅里葉紅外光譜圖Fig. 5 Infrared spectra of L. barbarum polysaccharides at different growth stages

研究表明在3 600～500 cm－1處具有多糖的特征吸收峰，由圖5可以看出，各個時期多糖的分子結構相似，均在3 422.16 cm－1處出現寬而強的—OH伸縮振動吸收峰，是多糖分子上的—OH，也包括分子內或分子間氫鍵，2 914.91、2 836.11 cm－1為—CH2—或—CH3的C—H伸縮振動，1 740.35 cm－1處有一明顯吸收峰，是醛基，為糖上的乙酰基，1 630.07、1 586.04 cm－1為—COOH的C=O伸縮振動吸收峰，1 365.25 cm－1為C—H的變形振動吸收峰，和C—H的伸縮振動都是糖類物質的特征吸收峰，1 140.35 cm－1為C—O—C醚鍵C—O的伸縮振動，1 016.42 cm－1處的吸收峰為吡喃糖苷，895.76 cm－1處為U-D吡喃糖特征吸收峰，由此可知是該純化后的多糖為β-吡喃型的酸性多糖，這也驗證了離子交換柱層析分離時根據離子強度判斷組分2為酸性多糖。

2.3.4 不同生長時期枸杞多糖的熱特性

圖6 枸杞不同生長期的多糖熱分析Fig. 6 Thermal analysis of L. barbarum polysaccharides at different growth stages

如圖6所示，結合TG和DSC曲線可知，各個時期多糖均在390～500 ℃之間有一次大的質量損失，在此溫度范圍之前和之后各個時期又略有不同，7、14、28、35 d多糖均在50～65 ℃之間有一次小的質量損失，21 d多糖變化不明顯，這可能與實驗過程中的操作有關系，這次質量損失主要是水分的損失，其中7 d多糖在500 ℃以后也有質量損失，21、28、35 d多糖在700 ℃以后都有較大的質量損失，這主要是多糖結構開始變化造成的損失。各個時期的放熱峰均集中在200～500 ℃之間，對應的失重曲線均有較大變化，其中7 d多糖在500 ℃以后還有一個放熱峰，35 d多糖在700 ℃以后也存在一個放熱峰，吸熱峰大多集中在300～400 ℃之間，但7、14、28、35 d多糖均在60 ℃左右多一個吸熱峰，14、21、28、35 d多糖又在700 ℃以后還有吸熱峰。由此可知各個時期多糖的熱特性存在差異，但隨著枸杞不斷成熟，多糖開始降解，結構發生變化，這與前面的結論一致。

2.3.5 不同生長時期枸杞多糖掃描電子顯微鏡觀察結果由圖7可知，多糖結構在各個時期不同，隨著枸杞生長發育不斷變化，由最初的致密片層逐步變化至松散山峰狀直至完全崩塌。第7天時多糖的片層比較完整、致密，表面有卷曲狀，放大之后，多糖結構呈卷曲狀緊緊的纏繞在一起，卷曲中間都有孔狀結構，但表面平整，說明這個時期多糖結構還很完整，第14天時多糖片狀表面出現大小不一的孔狀，高倍鏡下呈現的是一圓柱狀，表面致密，卷中孔狀縮小，即多糖結構的分子間作用力逐漸增強，第21天時，明顯看到片層狀開始瓦解，形成的圓柱狀表面孔隙變大，開始松散，第28天時，表面片層結構已消失，瓦解成山峰狀，高倍鏡下，表面結構極其松散，柱狀結構開始逐漸消失，到第35天時，多糖結構進一步裂解，以小小的片狀聚集體存在。

圖7 不同生長時期枸杞多糖掃描電子顯微鏡Fig. 7 Scanning electron microscopy images of L. barbarum polysaccharides at different growth stages

3 結 論

本實驗通過傳統水提法、Sevag法提取各生長時期多糖并脫蛋白后測定粗多糖含量、糖醛酸含量及可溶性蛋白含量，結果表明它們都呈現先增長后降低的趨勢，并采用離子交換柱對枸杞多糖進行分離，最終各時期均得到3 種多糖，且都為蛋白聚糖，其中選取提取率高變化穩定的酸性多糖2進行凝膠層析柱純化，結果顯示均為單一對稱峰，分離良好。

HPLC結果顯示不同生長時期枸杞多糖均為小分子多糖，GC-MS結果顯示枸杞多糖主要由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖組成。傅里葉紅外光譜結果表明純化的枸杞多糖是β-吡喃型的酸性多糖。熱分析得知各個生長期的多糖熱特性相似又各有差異，整體可看作是有2 次質量損失，先是水分脫出造成的，然后是多糖結構裂解。掃描電子顯微鏡觀察多糖結構在各個時期不同，由最初的致密片層逐步變化至松散山峰狀直至完全崩塌。這為將來研究枸杞多糖更深層次的性質和結構提供理論參考價值。