直接PCR法在獼猴桃潰瘍病檢測中的建立

李智念 羊煉 劉露

摘 要：通過優化PCR反應體系和反應程序，本文建立了使用獼猴桃枝條為樣品，直接檢測獼猴桃潰瘍病PSA病原菌的方法。該方法跳過了病原菌培養和DNA提取步驟，大大縮短了檢測時長，利用微型PCR儀系統，使針對獼猴桃潰瘍病的簡單、低成本、快速現場檢測成為可能。

關鍵詞：獼猴桃潰瘍病;檢測方法;直接PCR

中圖分類號：S436.634文獻標識碼：A文章編號：1003-5168（2020）20-0139-03

Abstract： By optimizing the PCR reaction system and reaction program， a method for directly detecting the pathogenic bacteria of kiwi fruit ulcer PSA by using kiwi twigs as a sample was established in this paper. The method skips the steps of pathogen culture and DNA extraction， greatly shortens the detection time， and utilizes a micro-PCR system， which makes simple， low-cost and fast on-site detection for kiwi fruit ulcer possible.

Keywords： kiwi fruit ulcer;detection method;direct PCR

近年來，我國獼猴桃種植面積不斷增加，細菌性潰瘍病快速蔓延[1-2]。在沒有特效防治藥品的現狀下，加強外引苗木的檢疫、及早清除園中感染植株是防范潰瘍病，避免果園全軍覆沒的重要手段。植株感病的早期雖然不表現出相應性狀，但已經具備傳播擴散致病菌的能力，要及早發現已染病植株并不容易。

PCR檢測能夠高效準確地鑒定出PSA病原菌，但現有的方法一般要首先采樣培養病原菌，然后提取培養出的菌落DNA，再進行PCR檢測。這樣的流程需要專業人員操作，很難應用到獼猴桃園的常規檢測。面對基層獼猴桃園主的自主快速檢測方法，目前國內還少有報道。本研究通過優化普通PCR的反應體系與程序，跳過病原物培養和DNA提取過程，直接以獼猴桃枝條為樣本進行PCR反應;整合現有儀器設備，避開了常規PCR試驗對高速離心機、成像系統或熒光定量系統的依賴，建立了一套簡單、可靠、準確、快速、低成本的檢測方法，旨在為發展出一種基層獼猴桃園主用得起、用得上的獼猴挑潰瘍病早期檢測技術，為我國獼猴桃栽培的健康發展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

從明顯發生潰瘍病的獼猴桃枝條中分離保存的PSA病原菌。

1.2 獼猴桃枝條

分別以明顯發生潰瘍病的獼猴桃枝條（見圖1）、未見病征的獼猴桃枝條（見圖2）和已確認未感染PSA病原菌的獼猴桃枝條（見圖3）為樣品。

1.3 PCR引物

通過文獻分析選取P3F/P5R（5′-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG-3′，5′-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3′）[3]用于PCR檢測，由上海生工進行合成。

1.4 獼猴桃枝條組織取樣量的確定

直接PCR檢測反應對樣品用量由一定要求，樣品量太少，會導致底物含量過低，無法完成檢測;樣品量太多會污染PCR反應體系，導致目標片段的擴增無法順利完成[4-9]。為確定取樣量的范圍，本試驗以ddH2O為陰性對照，以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽性對照，通過取不同質量的健康枝條樣品與PSA菌液混合進行PCR檢測來確定樣品取樣量的上限，通過從感病枝條中取不同重量樣品進行PCR檢測來確定樣品取樣量的下限。

PCR反應體系為：2×Taq PCR Master Mix10ul，上下游引物各0.5 μL，DNA模板10 μL。反應條件為：預變性95 ℃ 3 min; 95℃變性10 s，58 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s，38個循環;72 ℃延伸5 min;20 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，核算染料為低毒的GelRed染料。

1.5 檢測系統的輕簡化驗證

常規PCR結果判讀一般是，通過凝膠成像系統底部的紫外燈管，激發鑲嵌了核酸染料的DNA片段發出熒光，再通過頂部的相機鏡頭拍攝下條帶的照片，傳輸至計算機，呈現結果。為了適應基層低成本輕簡化的操作需求，人們可以嘗試使用紫外手電筒代替成像系統來激發條帶，直接目測判讀的方式來解讀PCR結果。

2 結果與分析

2.1 取樣量對PCR反應的影響

分別取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g確定未感染獼猴桃PSA菌的健康枝條，將其分別加入500 μL含有PSA菌的ddH2O中搗碎，取10 μL搗碎后的樣品混合液作為反應底物，進行PCR反應;以ddH2O為陰性對照，以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽性對照。如圖4所示，PCR結果表明，陽性對照擴增出目標條帶，而陰性對照未出帶，與預期相符，即反應體系正常工作;樣品質量在0.001～0.020 g的反應都擴增出條帶，并且以0.008 g樣品所對應的條帶亮度最高，而0.05～1.00 g樣品質量對應的反應都未見條帶。這表明在本檢測體系條件下，最適的取樣量為0.008 g左右，樣品量高于0.02 g則很可能會打亂反應體系，導致檢測PCR擴增無法進行。

分別取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g確定明顯感染獼猴桃PSA菌的枝條，將其分別加入500 μL的ddH2O中搗碎，取10 μL搗碎后的樣品混合液作為反應底物，進行PCR反應;以ddH2O為陰性對照，以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽性對照。如圖5所示，PCR結果表明，陽性對照擴增出目標條帶，而陰性對照未出帶，與預期相符，即反應體系正常工作;樣品量在0.008～0.020 g的反應都擴增出條帶，并且以0.008 g樣品所對應的條帶亮度最高，而0.05～1.00 g樣品質量和0.000 1～0.0050 g樣品質量對應的反應都未見條帶。這表明在本檢測體系條件下，取樣量低于0.005 g會導致模板量過低，無法檢測出已感病材料。

通過對不同取樣量的檢測結果分析可知，在21 μL反應體系下，取0.008～0.050 g的獼猴桃枝條組織，加入ddH2O（可用怡寶純凈水代替）中搗碎，取10 μL混合液作為PCR反應的底物，能完成獼猴桃PSA病原菌的直接PCR檢測。

2.2 輕簡化系統的可行性驗證

為適應基層果園無專業分子生物學實驗室、無專業分子檢測人員的應用場景，將實驗室已經驗證的方法進行了設備和試劑進行輕簡化嘗試。

試劑準備階段：將500 μL怡寶純凈水裝入1.5 mL EP管中;將引物與PCR反應MIX制成預混液，并分裝入PCR反應管中冷凍保存;將2%瓊脂糖凝膠制作完成后，用自封袋密封保存;將10 mL的50倍TAE母液裝入塑料試管保存。

模擬使用階段：分別取檢測范圍內的健康枝條樣品、染病枝條樣品，加入預裝500 μL純凈水的EP管中，小研磨輥磨碎，取10 μL加入預裝有反應液的PCR管中，上微型PCR儀器，以預定程序反應。將預裝的TAE母液倒入新開的怡寶純凈水中，搖勻制成電泳緩沖液體。將完成反應的PCR產物上樣到預制的瓊脂糖凝膠中，在微型電泳儀上進行電泳反應。電泳完成后用紫外手電筒照射，進行目視判定，染病枝條樣品出現明顯的亮條帶，而健康枝條樣品并未出現條帶，如圖6所示。

3 結論

隨著對獼猴桃潰瘍病菌（丁香假單胞菌獼猴桃變種Pseudomonas syrimgae PV.actinidiae，PSA）[10-13]研究的深入，基于普通PCR的檢測方法已經被逐漸建立和完善，如已報道的KN-RCR[14]、RG-PCR[15]等技術;也有基于定量PCR技術的檢測方法被報道。這些技術的建立，幫助專業人員準確地區分出PSA和其他相似菌株，可以對無病征、未發病的果園進行早期檢測。但是，這些檢測需要在專業的分子實驗室進行，需要具有相應分子生物學專業技能的人員操作，耗時較長，檢測成本較高。基層果園主難以應用PCR技術開展自主檢測，在日常果園管護中早發現、早處理還不現實。本研究通過實驗室驗證，建立了一套應用普通PCR檢試劑、傻瓜化檢測的方法，無須專業背景即可在說明指導下完成操作，結果準確。該方法所需儀器極為輕簡，相對于建立整套分子實驗室，成本低廉。本研究建立的獼猴桃潰瘍病快速檢測方法，降低了檢測操作難度、檢測成本，縮短了檢測時間，應用前景廣闊。

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