入侵福建的草地貪夜蛾的分子鑒定

王亞如　蔡香云　莊家祥　侯有明

摘要 草地貪夜蛾是世界糧農(nóng)組織預警的重大遷飛性害蟲。2019年1月被發(fā)現(xiàn)入侵我國，并迅速在我國擴散蔓延，在我國玉米種植區(qū)造成重大經(jīng)濟損失。本文利用線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（COⅠ）和位于Z染色體上的磷酸丙糖異構(gòu)酶（Tpi）基因的分子標記對采集于福建地區(qū)的84份草地貪夜蛾進行群體遺傳特征分析，結(jié)果顯示，基于COⅠ僅在南平邵武和南平建陽兩個地區(qū)鑒定到3份玉米型，其他81份均為水稻型;基于Tpi基因的檢測結(jié)果，84份樣品在174和175堿基處存在“AT”“GA”或“AT/GA”3種不同類型，但均為玉米型。福建省為亞熱帶季風氣候區(qū)，玉米終年都有種植，草地貪夜蛾可在該省越冬，本研究基于COⅠ和Tpi兩個基因片段的分子標記進行草地貪夜蛾兩種亞型的分子鑒定，為熱帶與南亞熱帶地區(qū)草地貪夜蛾的遷入遷出蟲源監(jiān)測預警提供了依據(jù)，為該入侵害蟲遺傳溯源積累了前期數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 草地貪夜蛾; 水稻型; 玉米型; 分子標記; 入侵害蟲

中圖分類號： S 435.132

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020138

Molecular identification of Spodoptera frugiperda invaded in Fujian province

WANG Yaru1， CAI Xiangyun1， ZHUANG Jiaxiang2， HOU Youming1*

（1. State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China;

2. Fujian Plant Protection and Plant Quarantine Station， Fuzhou 350003， China）

Abstract

Spodoptera frugiperda is a major migratory pest that FAO has warned about it. It invaded China in January 2019 and spread rapidly， causing significant economic losses in Chinas corn planting areas. In this study， the molecular markers of mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ（COⅠ） and triose phosphate isomerase （Tpi） located on the Z chromosome were used to analyze the population genetic characteristics of 84 S.frugiperda samples collected from Fujian province. The results showed that only 3 samples from Shaowu and Jianyang of Nanping county were identified as corn strain， and the other 81 samples were identified as rice strain by COⅠ gene. When using Tpi gene as marker， though three gene types including “AT” and “GA” or “AT/GA” at? position 174 and 175 were identified， all samples were corn strain. Fujian province belongs to subtropical monsoon climate area， and corn is planted all year round. S.frugiperda can overwinter here. This study used two molecular markers， COⅠand Tpi to identify the biotypes of S.frugiperda. The results provided a basis for the monitoring of the source of fall armyworms in tropical and southern subtropical regions， and accumulated preliminary data for the genetic tracing of the invasive pest.

Key words

Spodoptera frugiperda; rice strain; corn strain; molecular marker; invasive insects

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E.Smith）俗稱秋黏蟲（fall armyworm），是夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾屬Spodoptera的一種雜食性、遷飛性、檢疫性農(nóng)業(yè)害蟲[1]，可對農(nóng)作物造成毀滅性破壞。其原產(chǎn)于美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，寄主植物350多種，主要寄主為玉米和水稻。自2019年1月入侵我國后，草地貪夜蛾已擴散至我國20多個省（直轄市、自治區(qū)）[2]，為害玉米[3]、小麥[4]、花生[5]等作物，尤其是玉米種植區(qū)，因草地貪夜蛾為害已造成無法挽回的經(jīng)濟損失。

草地貪夜蛾成蟲遷飛能力極強，據(jù)報道其成蟲在風向合適時每晚可遷飛100 km[6]。草地貪夜蛾發(fā)源于美洲，于2016年入侵非洲，兩年內(nèi)非洲40多個國家都監(jiān)測到其入侵。由于取食的寄主植物不同，草地貪夜蛾分化出了兩種亞型——R型（rice strain， 水稻型）和C型（corn strain， 玉米型）[7]，目前兩種亞型草地貪夜蛾已在非洲定殖為害。這兩種亞型的草地貪夜蛾群體對寄主的趨向性和在不同寄主植物上的適應(yīng)性不同[8-10]，不同亞型的草地貪夜蛾在對轉(zhuǎn)基因植物的抗性表現(xiàn)[11-12]、農(nóng)藥抗性[13-14]、遷飛行為[15-16]等方面也存在差異。但是這兩種亞型在形態(tài)上無法區(qū)分，因此需要對兩種寄主型的草地貪夜蛾開展分子鑒定，主要手段是分子標記，其中來源于線粒體的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因（COⅠ）以及位于Z染色體上編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因（Tpi）是當前最常用的標記基因[17-19]。目前，針對入侵我國各省份的草地貪夜蛾的遺傳鑒定也主要使用COⅠ和Tpi分子標記[20-24]，結(jié)合這兩種分子標記更能厘清草地貪夜蛾的遺傳特性。

福建省為亞熱帶季風氣候區(qū)，終年都有玉米種植，草地貪夜蛾可在該省越冬，增加了該蟲的防治難

度。本研究基于COⅠ和Tpi兩個基因片段的分子標記對福建地區(qū)（福州、廈門、漳州、莆田、泉州、南平、三明等7市10縣/區(qū)）的草地貪夜蛾進行了分子

鑒定，對了解該入侵物種的遺傳結(jié)構(gòu)以及制定有效

預測預警防控策略具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲采集

本研究的草地貪夜蛾樣本來源于福建省福州閩侯洋里新見村、福州閩侯大湖村、漳州長泰陳港鎮(zhèn)石室村、南平順昌縣水口寨村、漳州長泰陳港鎮(zhèn)西湖村、莆田仙游游洋鎮(zhèn)梧椿村、廈門同安、南平建陽、三明永安、泉州惠安等10個地區(qū)（圖1） 的玉米田，共計84份，其中幼蟲為玉米田人工采集所得，成蟲為玉米田性誘劑誘捕所得，具體樣本信息見表1。樣品帶回實驗室后立即凍于液氮，備用。

1.2 DNA提取和PCR擴增

采用CTAB法分別提取單頭幼蟲或成蟲的DNA。單頭蟲體置于研缽中加液氮研磨成粉末，于2 mL離心管中抽提DNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后用作PCR擴增模板。用于COⅠ和Tpi分子標記的引物見表2。應(yīng)用TaKaRa Ex Taq試劑盒進行PCR擴增。反應(yīng)體系：10×Ex Taq buffer 5 μL，dNTP mixture 4 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預變性3 min;94℃變性30 s， 58℃（COⅠ）或49℃（Tpi） 退火30 s，72℃延伸30 s， 35個循環(huán);72℃延伸5 min; 12℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段特異性后切膠回收，并將PCR產(chǎn)物連接到pMDTM 19-T載體上。每個樣品各挑取4個克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。

1.3 序列分析

序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，并利用SeqMan和BioEdit軟件對正反向測序序列進行人工拼接及峰圖校正獲得的準確的COⅠ和Tpi基因片段序列。針對已報道的基于COⅠ和Tpi基因序列的水稻型和玉米型單倍型特點，參考從GenBank數(shù)據(jù)庫發(fā)布的草地貪夜蛾COⅠ和Tpi基因序列分別進行差異位點分析，進而確定本研究中草地貪夜蛾的亞型。

2 結(jié)果與分析

對所采集的福建省10個縣（區(qū)）的84份樣品利用標記COⅠ基因進行序列比對，分析其寄主型，結(jié)果（圖2）顯示，除南平邵武（NPSW）的2個樣本（NPSW-2和NPSW-7）和南平建陽（NPJY-6）的1個樣本的序列與已報道的草地貪夜蛾玉米型（HM136586）的序列一致外，其他包括這兩個地區(qū)在內(nèi)的81份樣品的序列與已報道的草地貪夜蛾水稻型（HM136593）序列一致，但本研究所采集樣本的寄主均為玉米，說明由COⅠ標記鑒定得到的寄主型與樣品來源的寄主型并不一致，但能夠鑒定出其與其他物種的區(qū)別。而Tpi基因序列的比對分析結(jié)果顯示，10個地區(qū)的樣本序列均與已報道的玉米型序列特征相符合（圖3），但部分樣本第174和175堿基為“AT”或“GA”，即存在174和175堿基處為“AT”或“GA”兩種基因型。本研究檢測的84份樣品中53份樣本只存在“AT”位點，11份樣本只存在“GA”位點，其他20份樣本的4個TA克隆子至少存在一條為“AT”位點（其他幾條為“GA”位點）或“GA”位點（其他幾條為“AT”位點），總體來說基于Tpi基因的序列分析顯示所有樣品均為玉米型，與其寄主型相符。

3 結(jié)論與討論

自2019年1月草地貪夜蛾入侵我國至今已一年，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和各地植保人員的觀察統(tǒng)計，草地貪夜蛾主要對我國玉米生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失，但也在其他農(nóng)產(chǎn)品植物上偶有發(fā)現(xiàn)，如：甘蔗[26]、花生[5]、甘藍[27]等，草地貪夜蛾在我國的定殖與擴散正值關(guān)鍵期，對其生態(tài)學、生物學、生理學特點及其在其他潛在寄主植物上的為害特點的研究對其防治尤其重要。

本研究通過COⅠ和Tpi基因分子標記對采自福建地區(qū)10縣（區(qū)）的84份草地貪夜蛾樣品的單倍型進行了分析，結(jié)果顯示，基于COⅠ的鑒定結(jié)果，3.57%的樣本為玉米型，96.43%的樣本為水稻型;而基于Tpi的鑒定結(jié)果顯示所有樣本均為玉米型。本文的研究結(jié)果與張磊等[21]的中國不同地區(qū)草地貪夜蛾種群生物型分子特征分析結(jié)果（基于線粒體COⅠ基因96%以上為水稻型，玉米型所占比例不到4%，基于Tpi基因分析結(jié)果表明所有樣品為玉米型）是一致的;與徐麗娜等[22]的入侵安徽省草地貪夜蛾的遺傳分析結(jié)果（基于COⅠ基因安徽省草地貪夜蛾樣本86.23%是水稻型，13.77%是玉米型，基于Tpi基因所有樣品為玉米型）也基本一致;Nagoshi等[28]2018年對采自非洲的樣本的檢測結(jié)果也是如此。導致兩種分子標記的鑒定結(jié)果不一致的原因可能是ZW型性別決定機制的草地貪夜蛾的COⅠ是線粒體基因，為母系遺傳，但Tpi基因位于Z染色體，且兩種亞型的草地貪夜蛾之間并不存在絕對的生殖隔離[29]。該結(jié)果也說明了入侵福建地區(qū)的草地貪夜蛾也許存在不同路徑，即侵入南平地區(qū)的草地貪夜蛾和福建其他幾個地區(qū)的草地貪夜蛾入侵路徑不同，這與前人關(guān)于草地貪夜蛾入侵我國可能存在不同路徑[30-31]的研究結(jié)果是一致的。

草地貪夜蛾作為聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）全球預警的遷飛害蟲，近年來被廣泛研究。由于玉米型與水稻型之間不存在絕對的生殖隔離，田間交叉雜交導致了草地貪夜蛾的遺傳復雜性，Nagoshi等[32-33]的研究表明，西半球的草地貪夜蛾根據(jù)COⅠ單倍型頻率的不同玉米型草地貪夜蛾又可細分為“FL型”和“TX型”，根據(jù)Tpi單倍型位點的不同玉米型草地貪夜蛾可細分為“Tpi-Ca1型”（MG603702）、“Tpi-Ca2型”（MG603703）和“Tpi-CaH型”[28]。單一種群的長期近交容易造成遺傳衰退，而草地貪夜蛾擁有極強的遷飛能力，這可能也是導致其遺傳復雜性的外在原因之一。目前國內(nèi)的許多研究表明侵入我國的草地貪夜蛾主要為雜交型[20-23]，理論上可能存在雜交優(yōu)勢，但草地貪夜蛾入侵我國僅一年，本地種還未完全形成，現(xiàn)階段依然是防治草地貪夜蛾的關(guān)鍵時期。

本研究綜合COⅠ和Tpi兩個分子標記的檢測結(jié)果表明，入侵福建地區(qū)的草地貪夜蛾94%以上是水稻型母本與玉米型父本雜交后代演化而來的雜合玉米型草地貪夜蛾。由于水稻型與玉米型草地貪夜蛾的抗藥性[13-14]、遷飛性[15-16]、寄主趨向及適應(yīng)性不同[1，8-9]，水稻型和玉米型又不存在絕對的生殖隔離，故理論上存在進化出水稻型的可能。福建省為亞熱帶季風氣候區(qū)，玉米、水稻、甘蔗等作物終年均有種植，是草地貪夜蛾天然適宜的定殖與越冬地，所以對草地貪夜蛾的發(fā)生與遷飛動態(tài)需要更多的關(guān)注。本研究對草地貪夜蛾展開分子鑒定有助于分析其來源、了解其遺傳特性、發(fā)生動態(tài)等，同時為當前我國處于起步階段的草地貪夜蛾群體遺傳研究積累理論數(shù)據(jù)，為指導防控提供科學信息。

參考文獻

[1] HARRISON R D， THIERFELDER C， BAUDRON F，et al. Agro-ecological options for fall armyworm （Spodoptera frugiperda J.E.Smith） management： Providing low-cost， smallholder friendly solutions to an invasive pest [J]. Journal of Environmental Management， 2019， 243： 318-330.

[2] 姜玉英， 劉杰， 謝茂昌， 等. 2019年我國草地貪夜蛾擴散為害規(guī)律觀測[J]. 植物保護， 2019， 45（6）： 10-19.

[3] 秦譽嘉， 楊冬才， 康德琳， 等. 草地貪夜蛾對我國玉米產(chǎn)業(yè)的潛在經(jīng)濟損失評估[J]. 植物保護， 2020， 46（1）： 69-73.

[4] 任學祥， 胡本進， 蘇賢巖， 等. 安徽發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾區(qū)別為害麥玉/麥豆輪作田小麥[J]. 植物保護， 2020， 46（2）： 287-288.

[5] 何莉梅， 趙勝園， 吳孔明. 草地貪夜蛾取食為害花生的研究[J]. 植物保護， 2020， 46（1）： 28-33.

[6] RWOMUSHANA I， BATEMSN M， BEALE T， et al. Fall armyworm： Impacts and implications for Africa [J]. Wallingford： CAB International， 2018： 1 -53.

[7] JACOBS A， VUUREN A V， RONG I H.Characterisation of the fall armyworm （Spodoptera frugiperda J.E.Smith） （Lepidoptera： Noctuidae） from South Africa [J]. African Entomology， 2018， 26（1）： 45-49.

[8] PASHLEY D P. Host-associated genetic differentiation in fall armyworm （Lepidoptera， Noctuidae）： a sibling species complex？ [J]. Annals of the Entomological Society of America， 1986， 79（6）： 898-904.

[9] PASHLEY D P. Quantitative genetics， development， and physiological adaptation in host strains of fall armyworm [J]. Evolution， 1988， 42（1）： 93-102.

[10]PASHLEY D P， HAMMOND A M， HARDY T N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains （Lepidoptera，Noctuidae） [J]. Annals of the Entomological Society of America， 1992， 85（4）： 400-405.

[11]STORER N P， BABCOCK J M， SCHLENZ M， et al. Discovery and characterization of field resistance to Bt maize： Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） in Puerto Rico [J]. Journal of Economic Entomology， 2010， 103（4）： 1031-1038.

[12]BANERJEE R， HASLER J， MEAGHER R， et al. Mechanism and DNA-based detection of field-evolved resistance to transgenic Bt corn in fall armyworm （Spodoptera frugiperda） [J/OL]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： e10877.DOI：10.1038/s41598-017-09866-y.

[13]CARVALHO R A， OMOTO C， FIELD L M， et al. Investigating the molecular mechanisms of organophosphate and pyrethroid resistance in the fall armyworm Spodoptera frugiperda [J/OL]. PLoS ONE， 2013， 8（4）： e62268.DOI：1371/journal.pone.0062268.

[14]YU S J， NGUYEN S N， ABO-ELGHAR G E. Biochemical characteristics of insecticide resistance in the fall armyworm，Spodoptera frugiperda （J.E.Smith） [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2003， 77（1）： 1-11.

[15]MITCHELL E R， MCNEIAL J N， WESTBROOK J K， et al. Seasonal periodicity of fall armyworm， （Lepidoptera：Noctuidae） in the Caribbean basin and Northward to Canada [J]. Journal of Entomological Science， 1991， 26（1）： 39-50.

[16]WESTBROOK J K， NAGOSHI R N， MEAGHER R L， et al. Modeling seasonal migration of fall armyworm moths [J]. International Journal of Biometeorology， 2015， 60（2）： 255-267.

[17]JUAREZ M L， MURUA M G， GARCIA M G， et al. Host association of Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） corn and rice strains in Argentina， Brazil， and Paraguay [J]. Journal of Economic Entomology， 2012， 105（2）： 573-582.

[18]NAGOSHI R N， KOFFI D， AGBOKA K， et al. Comparative molecular analyses of invasive fall armyworm in togo reveal strong similarities to populations from the eastern united states and the greater antilles [J/OL]. PLoS ONE， 2017， 12（7）： e0181982.DOI：10.1371/journal.pone.0181982.

[19]NAGOSHI R N， MEAGHER R L.Using intron sequence comparisons in the triose-phosphate isomerase gene to study the divergence of the fall armyworm host strains [J]. Insect Molecular Biology， 2016， 25（3）： 324-337.

[20]張磊， 靳明輝， 張丹丹， 等. 入侵云南草地貪夜蛾的分子鑒定[J]. 植物保護， 2019， 45（2）： 19-24.

[21]張磊， 柳貝， 姜玉英， 等. 中國不同地區(qū)草地貪夜蛾種群生物型分子特征分析[J]. 植物保護， 2019， 45（4）： 20-27.

[22]徐麗娜， 胡本進， 蘇賢巖， 等. 入侵安徽省草地貪夜蛾的遺傳分析[J]. 植物保護， 2019， 45（5）： 47-53.

[23]王佳麗， 韋加奇， 孫志秀， 等. 入侵我國中南三省草地貪夜蛾的單倍體型和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報， 2020， 41（1）： 9-16.

[24]陳冬平， 陳志廷， 徐漢虹， 等.應(yīng)用不同分子標記鑒別入侵廣州草地貪夜蛾的寄主型[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報， 2020， 41（1）：17-21.

[25]LEVY H C， GARCIA-MARUNIAK A， MARUNIAK J E. Strain identification of Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） insects and cell line： PCR-RFLP of cytochrome oxidase C subunitⅠgene [J]. Florida Entomologist， 2002， 85（1）： 186-190.

[26]孫東磊， 文明富， 李繼虎， 等. 廣東蔗區(qū)草地貪夜蛾為害調(diào)查初報[J]. 環(huán)境昆蟲學報， 2019， 41（6）： 1155-1162.

[27]劉銀泉， 王雪倩， 鐘宇巍. 草地貪夜蛾在浙江為害甘藍[J]. 植物保護， 2019， 45（6）： 90-91.

[28]NAGOSHI R N， GOERGE G， TOUNOU K A， et al. Analysis of strain distribution， migratory potential， and invasion history of fall armyworm populations in northern Sub-Saharan Africa [J/OL]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 3710.https：∥doi.org/10.1038/s41598-018-21954-1.

[29]DUMAS P， LEGEAI F， LEMAITRE C， et al. Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） host-plant variants： two host strains or two distinct species？ [J]. Genetica， 2015， 143（3）： 305-316.

[30]LI Xijie， WU Mingfei， MA Jian， et al. Prediction of migratory routes of the invasive fall armyworm in eastern china using a trajectory analytical approach [J]. Pest Management Science， 2020， 76（2）： 454-463.

[31]吳秋琳， 姜玉英， 吳孔明， 草地貪夜蛾緬甸蟲源遷入中國的路徑分析[J]. 植物保護， 2019， 45（2）： 1-6.

[32]NAGOSHI R N， SILVIE P， MEAGHER R L. Comparison of haplotype frequencies differentiate fall armyworm （Lepidoptera：Noctuidae） corn-strain populations from Florida and Brazil [J]. Journal of Economic Entomology， 2007， 100（3）： 954-961.

[33]NAGOSHI R N， ROSAS-GARCIA N M， MEAGHER R L， et al. Haplotype profile comparisons between Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） populations from Mexico with those from Puerto Rico， South America， and the United States and their implications to migratory behavior [J]. Journal of Economic Entomology， 2015， 108（1）： 135-144.

（責任編輯：王 音）