厚皮香枯梢病病原菌鑒定

孫榮華　徐穎　王章訓(xùn)　路廣亮　許能春　黃國(guó)培

摘要 厚皮香枯梢病在上海地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。本研究對(duì)上海地區(qū)的厚皮香枯梢病進(jìn)行了病原菌的分離與致病性鑒定，得到其病原菌菌株2017SHTg。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征將其鑒定為小新殼梭孢Neofusicoccum parvum。擴(kuò)增病原菌2017SHTg的rDNA-ITS序列和翻譯延伸因子EF-1α基因序列，進(jìn)行BLAST序列比對(duì)與小新殼梭孢相似性分別為99%和100%;基于rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，其在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與小新殼梭孢的類(lèi)群處于同一分支，此結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞 厚皮香; 枯梢病; 小新殼梭孢

中圖分類(lèi)號(hào)： S 432.44

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019148

Identification of pathogen causing dieback on Ternstroemia gymnanthera

SUN Ronghua1，2， XU Ying1，2*， WANG Zhangxun1，2， LU Guangliang1，2， XU Nengchun3， HUANG Guopei4

（1. Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning， Shanghai 200232， China;

2. Shanghai Engineering Research Center of Landscaping on Challenging Urban Site， Shanghai

200232， China; 3. Shanghai Gardens Group Co.， Ltd， Shanghai 200335， China;

4. Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）

Abstract

Dieback is a widespread disease on Ternstroemia gymnanthera in Shanghai. Isolate 2017SHTg was proved as causal pathogen through isolation and pathogenicity test. Morphological characters of 2017SHTg were in agreement with Neofusicoccum parvum. Sequence analysis on rDNA-ITS and EF-1α of 2017SHTg showed 99% and 100% similarity to that of N.parvum， and phylogenetic analysis also showed 2017SHTg is attributed to the same branch with N.parvum in phylogenetic tree. These results showed that the causal pathogen causing dieback on T.gymnanthera in Shanghai is N.parvum.

Key words

Ternstroemia gymnanthera; dieback; Neofusicoccum parvum

厚皮香Ternstroemia gymnanthera是山茶科厚皮香屬灌木或小喬木，因其樹(shù)形優(yōu)美、枝葉層次感強(qiáng)，是一種優(yōu)良的常綠觀賞樹(shù)種。近年來(lái)，隨著厚皮香在上海地區(qū)栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，栽培中出現(xiàn)的病害尤其是厚皮香枯梢病造成的危害愈來(lái)愈重。厚皮香枯梢病發(fā)病初期，葉片表現(xiàn)為褪綠發(fā)黃、葉片所在的小枝皺縮萎蔫，鋸開(kāi)枝干可見(jiàn)褐色至深褐色的病斑。隨著病情不斷擴(kuò)展，發(fā)病枝干會(huì)逐漸枯死，危害嚴(yán)重時(shí)整株厚皮香死亡。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于厚皮香的病害研究還未見(jiàn)報(bào)道，為了明確厚皮香枯梢病的病原菌種類(lèi)與發(fā)病機(jī)制，針對(duì)其提出合理有效的預(yù)防及防治措施，本研究對(duì)厚皮香枯梢病的危害和癥狀進(jìn)行了觀察，開(kāi)展了病原菌的分離純化、致病性測(cè)定，并利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)合核糖體rDNA-ITS、翻譯延伸因子EF-1α的序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)研究，以期為病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

2017年4月-5月從上海地區(qū)青浦趙巷苗圃厚皮香上采集發(fā)病枝干，采用組織分離法從病健交界處取樣進(jìn)行病原菌分離，于PDA平板上25℃培養(yǎng)，挑取菌落邊緣的菌絲塊轉(zhuǎn)移純化，將純化后的菌株保存于4℃冰箱備用。

1.2 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定。選取長(zhǎng)20～40 cm的健康厚皮香枝條插于盛水三角瓶中。用無(wú)菌手術(shù)刀劃傷枝條表皮形成長(zhǎng)度為1 cm的傷口，將菌絲塊正面朝向傷口，用已浸濕無(wú)菌水的脫脂棉保濕，將接種后的枝條放入（25±1）℃，光周期L∥D=14 h∥10 h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)菌株重復(fù)接種3個(gè)枝條，并設(shè)置清水對(duì)照。接種后5～7 d觀察發(fā)病情況，并對(duì)發(fā)病枝條進(jìn)行病原菌再分離[1]。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將純化菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板上，于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征。將發(fā)病枝條于（25±1）℃保濕培養(yǎng)10～14 d后，于發(fā)病部位可觀察到分生孢子器，對(duì)病組織進(jìn)行切片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征并測(cè)量分生孢子大小。

1.4 病原菌分子鑒定

將菌株于25℃ PDA平板上培養(yǎng)4 d，刮取表面菌絲，CTAB法提取和純化基因組DNA。采用真菌rDNA-ITS通用引物ITS-fung1（5′-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增;同時(shí)用引物EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）對(duì)病原菌的翻譯延伸因子EF-1α基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序所得序列提交到GenBank，在NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(duì)（http：∥ncbi.n-lm.nih.gov/blast），并運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)以確定病原菌的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

近幾年筆者對(duì)上海地區(qū)厚皮香枯梢病危害癥狀進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)該病害在上海地區(qū)始發(fā)于3月下旬，主要表現(xiàn)在嫩枝與枝梢上的葉片失水、褪綠，枝條萎蔫、枯死。隨著病害的發(fā)展，小枝整枝枯萎（圖1a）;此病害也可侵染較大的枝干，較大枝干受侵染后，其上生長(zhǎng)的葉片均變褐枯萎，橫剖枝干，在木質(zhì)部可見(jiàn)紅褐色至深褐色的病變（圖1b）。

2.2 病原菌致病性

對(duì)典型發(fā)病枝干進(jìn)行病原菌分離，得到的菌株菌落形態(tài)一致，將其命名為2017SHTg，在離體條件下將其分別接種厚皮香的嫩枝與枝條，接種后病害癥狀發(fā)展迅速。接種7 d后觀察，嫩枝枝干上可見(jiàn)黑色病斑（圖2a）;枝條接種處上部葉片皺縮、褪綠，接種枝條萎蔫、枯死（圖2b）;接種清水的對(duì)照均不發(fā)病。2017SHTg菌落接種厚皮香嫩梢和枝條的發(fā)病癥狀與厚皮香自然狀態(tài)下的感染癥狀相同。對(duì)接種發(fā)病的厚皮香枝干進(jìn)行病原菌再次分離，所得分離物與原分離物菌落形態(tài)一致，證明2017SHTg為厚皮香枯梢病病原菌。

2.3 病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

病原菌在PDA平板上于25℃恒溫培養(yǎng)2～3 d后，長(zhǎng)出邊緣整齊的菌落，初期氣生菌絲灰白色、菌落生長(zhǎng)較快，5～6 d后菌絲轉(zhuǎn)灰黑色至黑色（圖3a），菌落生長(zhǎng)達(dá)30 d時(shí)仍未見(jiàn)產(chǎn)孢。將發(fā)病厚皮香枝條離體保濕培養(yǎng)10～14 d后，在發(fā)病枝條上肉眼可見(jiàn)黑色圓球形粒狀物的分生孢子器，顯微鏡下可見(jiàn)分生孢子器周?chē)写罅糠稚咦樱稚咦铀笮螣o(wú)色單孢，內(nèi)含多個(gè)不規(guī)則形球狀物，分生孢子頂端鈍圓，基部平截。分生孢子大小為（12.04～19.47）μm×（4.63～7.41）μm（圖3b）。根據(jù)該病原菌的菌落和分生孢子形態(tài)特征，將該病原菌初步鑒定為小新殼梭孢Neofusicoccum parvum。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

分別以ITS1-fungl、ITS4和EF1-728F、EF1-986R為引物對(duì)病原菌的rDNA-ITS和EF-1α基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序后得到長(zhǎng)度為586 bp的rDNA-ITS序列（GenBank登錄序列號(hào)為MH027962）和294 bp的EF-1α基因序列（GenBank登錄序列號(hào)為MK781982）;將兩種序列分別與GenBank中核苷酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，目標(biāo)序列與小新殼梭孢N.parvum的相似性分別為99%和100%。對(duì)rDNA-ITS序列經(jīng)MEGA5.0軟件采用鄰接法（neighbor joining，NJ）進(jìn)行聚類(lèi)分析，bootstrap值為1 000，結(jié)果表明，所測(cè)菌株2017SHTg序列MH027962與GenBank中N.parvum的遺傳距離最近，位于發(fā)育樹(shù)的同一分支（圖4）。同源性比對(duì)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)位置進(jìn)一步證明了厚皮香枯梢病的病原菌為小新殼梭孢N.parvum。

3 討論

小新殼梭孢Neofusicoccum parvum （Pennycook & Samuels） Crous， Slippers &A.J.L Phillips是子囊菌葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae的一種無(wú)性型菌物[2-3]。新殼梭孢Neofusicoccum是Crous等基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)于2006年建立的一個(gè)新屬，其對(duì)應(yīng)的有性型為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria，小新殼梭孢是新殼梭孢Neofusicoccum的模式種[3]。小新殼梭孢是引起多種林木和果樹(shù)病害的常見(jiàn)病原真菌[4-5]，它對(duì)油桐、柑橘、藍(lán)莓、鱷梨、芒果、桃、杏等多種林木和果樹(shù)均可造成危害，引起枝條枯萎或莖干潰瘍[6-9]。

本研究中侵染厚皮香的小新殼梭孢在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生分生孢子，病組織在25℃恒溫保濕培養(yǎng)10～14 d后在發(fā)病部位可產(chǎn)生分生孢子器和分生孢子，分生孢子為梭形無(wú)色單孢，為類(lèi)殼梭孢無(wú)性型，未發(fā)現(xiàn)其他類(lèi)型的分生孢子。在PDA培養(yǎng)基和病組織上均未觀察到有性世代，這與前人[3，10-11]的研究結(jié)果一致，小新殼梭孢不易在人工培養(yǎng)基或病斑組織上產(chǎn)生有性世代。雖然ITS序列被認(rèn)為是中等保守的，不易區(qū)分種間差異[12]，但在本研究中基于rDNA-ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以將小新殼梭孢和新殼梭孢其他種如N.arbuti或N.ribis很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。

厚皮香枯梢病病原菌的鑒定為此病害的防治提供了基礎(chǔ)和依據(jù)，但該病害的發(fā)生流行規(guī)律、侵染循環(huán)及防治措施等還需進(jìn)一步研究明確，尤其是小新殼梭孢寄主范圍廣泛，本研究中的小新殼梭孢2017SHTg是否也可引起其他多種植物的潰瘍或枯梢值得進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：王 音）