柑橘大實(shí)蠅滯育蛹海藻糖酶和山梨醇脫氫酶活性的動(dòng)態(tài)變化

周志雄　袁江江　李世香　梁玲　李傳仁

摘要 柑橘大實(shí)蠅Bactrocera minax （Enderlein）是我國(guó)西南和華中地區(qū)柑橘的主要害蟲，以滯育蛹在土壤中越冬。為探討溫度對(duì)柑橘大實(shí)蠅滯育蛹生理狀態(tài)的影響，本文測(cè)定了12、16、20℃和24℃下柑橘大實(shí)蠅滯育蛹海藻糖酶和山梨醇脫氫酶活性的變化。結(jié)果顯示，低溫（12℃）下，海藻糖酶活性逐漸上升，高溫（24℃）下，海藻糖酶活性逐漸下降;不同溫度下山梨醇脫氫酶活性變化不盡相同，在起始階段（10 d時(shí)），柑橘大實(shí)蠅滯育蛹山梨醇脫氫酶活性普遍較強(qiáng)，隨滯育時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性出現(xiàn)不同的變化，12℃和20℃下，山梨醇脫氫酶活性呈現(xiàn)“U”形變化趨勢(shì)，16℃下酶活性逐漸減弱，24℃下酶活性先升后降。16℃下，兩種酶活性基本低于同時(shí)期其他溫度處理。交互作用分析顯示，溫度和化蛹后天數(shù)的交互作用對(duì)滯育蛹海藻糖酶和山梨醇脫氫酶活性存在顯著影響。上述結(jié)果表明，柑橘大實(shí)蠅自身生理狀態(tài)應(yīng)對(duì)不同越冬溫度的反應(yīng)不同，說(shuō)明越冬溫度與柑橘大實(shí)蠅滯育期生理水平有著密切的關(guān)系。本研究結(jié)果對(duì)深入了解溫度調(diào)控柑橘大實(shí)蠅滯育期代謝生理機(jī)制有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 柑橘大實(shí)蠅; 滯育; 越冬溫度; 海藻糖酶; 山梨醇脫氫酶

中圖分類號(hào)： S 436.661， Q 965

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019241

Activity of trehalase and sorbitol dehydrogenase of the Chinese citrus fruit fly， Bactrocera minax （Enderlein） during diapause period

ZHOU Zhixiong， YUAN Jiangjiang， LI Shixiang， LIANG Ling， LI Chuanren*

（Institute of Entomology， Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

Abstract

Bactrocera minax （Enderlein） is an important citrus pest in southwestern and central China， which overwinters as pupae in diapause in the soil. To investigate the effects of overwintering temperature on the physiological state of the Chinese citrus fruit fly during diapause， the changes in the activity of trehalase and sorbitol dehydrogenase of the Chinese citrus fruit fly overwintering at 12， 16， 20 and 24℃ during diapause period were determined. The results showed that the activity of trehalase gradually increased at lower temperature （12℃）， and decreased gradually at higher temperature （24℃）. Under different overwintering temperatures， the activity of sorbitol dehydrogenase was different. At the initial stage of diapause （10 d）， the activity of sorbitol dehydrogenase was generally higher. With the prolongation of days after pupation， the enzyme activity exhibited different changes. At 12℃ and 20℃， the activity of sorbitol dehydrogenase showed a “U” type change trend， and gradually decreased at 16℃， and rose and then dropped at 24℃. At 16℃， the activities of these two enzymes were basically lower than at other temperatures in the same time. Interactive analysis showed that temperatures and days after pupation had a significant effect on the activity of trehalase and sorbitol dehydrogenase of B.minax pupae in diapause. These results indicated that the physiological state of the Chinese citrus fruit fly had different responses to different overwintering temperatures， and the overwintering temperature was closely related to the physiological level of the Chinese citrus fruit fly during diapause period. The present work provides a reference for understanding the regulation of physiological metabolism of the Chinese citrus fruit fly in diapause by overwintering temperatures.

Key words

Bactrocera minax; diapause; overwintering temperature; trehalase; sorbitol dehydrogenase

柑橘大實(shí)蠅Bactrocera minax （Enderlein）俗稱“柑蛆”，是我國(guó)西南和華中地區(qū)柑橘的主要害蟲，能夠嚴(yán)重影響柑橘果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。柑橘大實(shí)蠅為一化性昆蟲，以專性滯育（化蛹后開(kāi)始進(jìn)入滯育狀態(tài)）蛹在土壤中越冬，滯育期長(zhǎng)達(dá)4～5個(gè)月，滯育解除后繼續(xù)發(fā)育一個(gè)月左右，在翌年4月下旬至5月上旬成蟲開(kāi)始羽化，6月中旬開(kāi)始在柑橘果實(shí)中產(chǎn)卵，8月中旬幼蟲孵化后為害果實(shí)[2-5]。

滯育是昆蟲為了躲避不良環(huán)境而中止發(fā)育的一種適應(yīng)行為[6-7]，在滯育過(guò)程中昆蟲以最經(jīng)濟(jì)的能量利用方式進(jìn)行較緩慢的生命活動(dòng)來(lái)度過(guò)漫長(zhǎng)的滯育期。海藻糖和山梨醇是滯育昆蟲體內(nèi)存在的兩種重要物質(zhì)，作為昆蟲的“血糖”，海藻糖既能作為能量物質(zhì)來(lái)源，也能協(xié)助細(xì)胞抵御多種環(huán)境脅迫[8-13]，昆蟲體內(nèi)唯一可以降解海藻糖的海藻糖酶能將一分子海藻糖分解成為兩分子葡萄糖，再進(jìn)一步通過(guò)糖酵解為昆蟲提供能量[14-16]。同樣，山梨醇也能作為昆蟲越冬期抗寒物質(zhì)，在山梨醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成糖原，為昆蟲滯育期提供能量。因此，海藻糖酶和山梨醇脫氫酶對(duì)昆蟲滯育期能量代謝的調(diào)控起到極其重要的作用。迄今為止，對(duì)昆蟲滯育研究的結(jié)果表明，昆蟲體內(nèi)海藻糖酶和山梨醇脫氫酶是其滯育起始和終止階段的2個(gè)關(guān)鍵性酶[17]。

研究表明，溫度是影響柑橘大實(shí)蠅越冬存活的主要因子之一，溫度過(guò)高（30℃以上）或過(guò)低（10℃以下）均不利于柑橘大實(shí)蠅蛹的存活和成蟲的羽化[5]，15～20℃是柑橘大實(shí)蠅越冬的適宜溫區(qū)[18]。為深入了解柑橘大實(shí)蠅越冬蛹在滯育過(guò)程中體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)代謝變化規(guī)律，本文研究了柑橘大實(shí)蠅滯育蛹在12、16、20℃和24℃條件下越冬其體內(nèi)海藻糖酶和山梨醇脫氫酶活性的變化，為柑橘大實(shí)蠅越冬蛹滯育代謝生理機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2016年10月初，從湖北松滋市溫州蜜柑園采集落地蛆果，在實(shí)驗(yàn)室剝出落果中柑橘大實(shí)蠅幼蟲。在采集供試蟲源之前，先將河沙烘干，然后添加蒸餾水將河沙濕度調(diào)至15%～20%，再將濕河沙盛于直徑20 cm的花盆中;將柑橘大實(shí)蠅幼蟲置于室內(nèi)裝有濕河沙的花盆中自然化蛹，每隔2 d檢視花盆中柑橘大實(shí)蠅的化蛹進(jìn)度并撿出蛹，以前后2次撿出的蛹為同期蛹。

1.2 試驗(yàn)處理

以第2次撿出蛹的時(shí)間為起始點(diǎn)，選取兩次化蛹、體型相近的同期滯育蛹800頭，立即隨機(jī)分成4組，按50頭/盆分別置于12、16、20℃和24℃光照培養(yǎng)箱（L∥D=14 h∥10 h）中飼養(yǎng)，并保持花盆中河沙濕度在15%～20%之間。在化蛹后10、30、70 d和110 d收集各溫度處理下的滯育蛹20頭，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干后稱重。用液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存待測(cè)，但鑒于柑橘大實(shí)蠅蛹在24℃條件下的滯育蛹期僅持續(xù)50 d左右，故該處理下僅收集化蛹10、30 d和50 d的樣品。

1.3 柑橘大實(shí)蠅滯育相關(guān)酶活性測(cè)定

酶液的制備：取每處理越冬蛹，稱量后于冰浴中迅速研磨，加5 mL預(yù)冷緩沖液。海藻糖酶的緩沖液為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.8），山梨醇脫氫酶的緩沖液為0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8，內(nèi)含Tris 0.2 mol/L，MgCl2 25 mmol/L， NaN3 15 mmol/L）。樣品在冰浴中勻漿，勻漿液于4℃下16 000 g（Eppendorf Centrifuge 5810 R）離心10 min，取上清液作為酶液[19]。

海藻糖酶和山梨醇脫氫酶活性的測(cè)定分別參考李志剛等[19]和Negm等[20]的方法，采用紫外分光光度計(jì)（Beckman Coulter DU-730）分別在550 nm和340 nm測(cè)定吸光值。每處理重復(fù)4次。兩種酶活性以每分鐘每毫升反應(yīng)液的吸光度變化值為活性單位（OD/（mL·min））。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS（SPSS Inc.， Chicago， USA）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。所得柑橘大實(shí)蠅滯育蛹兩種酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和雙因素方差分析，平均數(shù)差異均采用Tukey法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖酶活性的變化動(dòng)態(tài)

溫度和化蛹后天數(shù)綜合作用下柑橘大實(shí)蠅滯育蛹海藻糖酶活性如圖1所示。溫度和化蛹后天數(shù)對(duì)柑橘大實(shí)蠅滯育蛹海藻糖酶活性均有顯著影響，兩因素交互作用也存在顯著影響（表1）。

在相同溫度下，滯育蛹海藻糖酶活性隨化蛹后天數(shù)而變化。在12℃條件下，滯育蛹海藻糖酶活性隨化蛹后天數(shù)逐漸增強(qiáng)，在110 d時(shí)活性最強(qiáng);16℃下，海藻糖酶活性隨化蛹后天數(shù)先增后減，在30 d時(shí)最高，110 d時(shí)最低;20℃時(shí)，海藻糖酶活性在滯育期呈現(xiàn)升-降-升的變化模式，在30 d時(shí)酶活性達(dá)到最強(qiáng)，70 d時(shí)活性最弱;24℃時(shí)，酶活性強(qiáng)度隨化蛹后天數(shù)逐漸減弱，且10 d時(shí)酶活性顯著強(qiáng)于30 d和50 d，30 d和50 d之間無(wú)顯著差異（圖1）。

在相同滯育期，滯育蛹海藻糖酶活性隨溫度而不同。處理10 d后，海藻糖酶活性隨溫度升高先減后增，24℃下酶活性顯著高于其他溫度;處理30 d后，20℃下酶活性最高，顯著高于12℃和16℃的酶活性;70 d時(shí)，海藻糖酶活性隨溫度升高呈現(xiàn)降-升的變化趨勢(shì)，16℃條件下酶活性最低，12、16和20℃之間酶活性無(wú)顯著差異;110 d之后，海藻糖酶活性隨溫度升高呈現(xiàn)降-升的變化趨勢(shì)，在16℃下酶活性顯著低于12℃和20℃，12℃和20℃之間無(wú)顯著差異（圖1）。

以溫度和化蛹后天數(shù)作為單一因子分析后發(fā)現(xiàn)，不同溫度條件比較，16℃條件下柑橘大實(shí)蠅滯育蛹海藻糖酶活性最低，顯著低于20℃和24℃，24℃條件下酶活性最高（圖2a）;化蛹后不同天數(shù)比較，70 d時(shí)酶活性最低，且顯著低于10 d和30 d，10 d時(shí)酶活性最高（圖2b）。

2.2 山梨醇脫氫酶活性的變化動(dòng)態(tài)

柑橘大實(shí)蠅滯育蛹山梨醇脫氫酶活性隨溫度和滯育期的變化動(dòng)態(tài)如圖3所示。溫度和化蛹后天數(shù)對(duì)柑橘大實(shí)蠅滯育蛹山梨醇脫氫酶活性均有顯著影響，兩因素交互作用也存在顯著影響（表1）。

在相同溫度下，滯育蛹山梨醇脫氫酶活性隨化蛹后天數(shù)而變化。由圖3可見(jiàn)，不同溫度下，隨化蛹后天數(shù)增加，山梨醇脫氫酶活性變化趨勢(shì)不同。12℃下，山梨醇脫氫酶活性基本維持不變，30 d時(shí)酶活性最低，110 d時(shí)酶活性最高;16℃下，30 d之前酶活性無(wú)顯著變化，30 d后酶活性顯著降低;20℃條件下，山梨醇脫氫酶活性隨化蛹后天數(shù)呈現(xiàn)“U”形變化趨勢(shì)，10 d時(shí)活性最強(qiáng)，之后酶活性逐漸降低，70 d時(shí)酶活性最低，隨后緩慢增強(qiáng);24℃時(shí)，滯育期酶活性呈倒“U”形變化，在30 d時(shí)酶活性最強(qiáng)。

在相同滯育期，滯育蛹的山梨醇脫氫酶活性隨溫度變化而不同。處理10 d后，山梨醇脫氫酶活性強(qiáng)度順序?yàn)?0℃>24℃>12℃>16℃，其中20℃時(shí)活性顯著高于12℃和16℃，12℃、16℃和24℃之間無(wú)顯著差異;30 d后，20℃下酶活性最低，24℃下酶活性最高并顯著高于12℃、16℃和20℃下的酶活性;處理后70 d和110 d，16和20℃條件下滯育蛹山梨醇脫氫酶活性顯著低于12℃，且16℃下酶活性最低，酶活性隨溫度升高呈現(xiàn)降-升的變化趨勢(shì)。

以溫度和化蛹后天數(shù)作為單因子分析結(jié)果如圖4所示。16℃條件下滯育蛹山梨醇脫氫酶活性最低，顯著低于12、20℃和24℃，24℃條件下酶活性最高（圖4a）;不同時(shí)期中，70 d時(shí)酶活性最低，且顯著低于10 d和30 d，10 d時(shí)酶活性最高（圖4b）。

3 討論

在滯育期，昆蟲主要通過(guò)消耗自身儲(chǔ)存的能量物質(zhì)來(lái)維持生命活動(dòng)，作為昆蟲的“血糖”，海藻糖在昆蟲生命活動(dòng)中發(fā)揮著極其重要的作用[12]。本文測(cè)定了滯育期不同溫度下柑橘大實(shí)蠅蛹海藻糖酶活性的變化。結(jié)果表明，不同溫度下，海藻糖酶活性變化趨勢(shì)不盡相同，在滯育起始階段，海藻糖酶活性與溫度呈正相關(guān)，處理10 d后，各溫度下海藻糖酶活性變化趨勢(shì)不同，說(shuō)明柑橘大實(shí)蠅在滯育期應(yīng)對(duì)不同恒溫越冬條件的反應(yīng)不同。在自然條件下，滯育期柑橘大實(shí)蠅海藻糖含量呈現(xiàn)升-降的變化趨勢(shì)，且海藻糖酶活性變化也呈現(xiàn)升-降的趨勢(shì)[21]，本研究中低溫和高溫越冬條件下，隨化蛹后天數(shù)增加海藻糖酶活性分別逐漸升高和降低。因此，在柑橘大實(shí)蠅體內(nèi)海藻糖含量的高低可能與海藻糖酶活性的變化并非呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系[12，22]，同時(shí)，作為抗寒物質(zhì)，在柑橘大實(shí)蠅體內(nèi)，海藻糖可能不是主要的抗寒物質(zhì)，但海藻糖酶在滯育起始階段之后的作用有待進(jìn)一步研究。

山梨醇是生物體內(nèi)重要的抗逆物質(zhì)之一[17]。大量研究表明，許多滯育昆蟲體內(nèi)山梨醇的含量變化與其滯育的開(kāi)始、維持和解除存在密切的關(guān)系[23]。其能夠催化山梨醇脫氫轉(zhuǎn)化成糖原，而糖原是滯育昆蟲重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，山梨醇脫氫酶在昆蟲滯育中有著重要作用。本文研究結(jié)果表明，不同越冬溫度條件下，滯育期蛹山梨醇脫氫酶活性變化趨勢(shì)不盡相同。在滯育起始階段（10 d時(shí)），柑橘大實(shí)蠅越冬蛹體內(nèi)山梨醇脫氫酶活性普遍較強(qiáng)，隨化蛹后天數(shù)的增加，酶活性出現(xiàn)不同的變化，可能在滯育起始期，越冬蛹體內(nèi)山梨醇被轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)來(lái)保證滯育開(kāi)始的物質(zhì)需求。10 d之后，酶活性變化趨勢(shì)不同，與滯育期溫度無(wú)明顯的相關(guān)性。

山梨醇脫氫酶作為滯育解除過(guò)程中的關(guān)鍵酶[17]，在滯育解除階段，山梨醇在山梨醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成糖原，進(jìn)而分解作為昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的能源物質(zhì)。因此，在柑橘大實(shí)蠅越冬蛹的滯育后期可能會(huì)出現(xiàn)山梨醇脫氫酶活性上升的階段。本文研究結(jié)果中，在16℃和24℃條件下，在滯育后期，山梨醇脫氫酶活性未出現(xiàn)上升的變化，并且在12℃條件下，110 d時(shí)酶活性未出現(xiàn)顯著的上升。這一情況可能與柑橘大實(shí)蠅滯育解除時(shí)間有關(guān)，12℃和16℃條件下越冬時(shí)，滯育解除時(shí)期可能在110 d之后，在20℃下越冬，滯育解除期可能在70～110 d之間，而在24℃下越冬時(shí)，滯育解除期可能在30～50 d之間，因此，在12℃和16℃條件下越冬110 d之后，山梨醇脫氫酶活性可能會(huì)出現(xiàn)顯著上升。這與溫度調(diào)控柑橘大實(shí)蠅越冬蛹的發(fā)育可能存在密切的關(guān)系。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫（12℃）和高溫（20℃和24℃）條件下越冬，柑橘大實(shí)蠅越冬蛹海藻糖酶和山梨醇脫氫酶活性基本高于同時(shí)期在16℃下越冬個(gè)體，且在16℃下，隨滯育期的延長(zhǎng)，蟲體兩種酶活性基本呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，由此可以看出，在16℃下越冬，越冬個(gè)體可能對(duì)海藻糖和山梨醇需求程度逐漸減弱，且可能在此條件下越冬，蟲體會(huì)出現(xiàn)海藻糖和山梨醇的積累，同時(shí)為滯育解除后的發(fā)育提供能量保證。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳世驤，謝蘊(yùn)貞.關(guān)于桔大實(shí)蠅的學(xué)名及其種征[J].昆蟲學(xué)報(bào)，1955，5（1）：123-126.

[2] 汪興鑒，羅祿怡.桔大實(shí)蠅的研究進(jìn)展[J].昆蟲知識(shí)，1995，32（5）：310-315.

[3] 王小蕾，張潤(rùn)杰.桔大實(shí)蠅生物學(xué)，生態(tài)學(xué)及其防治研究概況[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2009，31（1）：73-79.

[4] 吳志清.桔大實(shí)蠅的生活習(xí)性觀察初報(bào)[J].昆蟲知識(shí)，1958， 4（5）：216-217.

[5] 羅祿怡，陳長(zhǎng)風(fēng).柑桔大實(shí)蠅蛹的生物學(xué)特性[J].中國(guó)柑桔，1987，4（3）：9-10.

[6] DANKS H V. Insect dormancy：an ecological perspective. Biological survey of Canada （Terrestrial Arthropods） [M].Ottawa：National Museum of Sciences，1987：114-122.

[7] TAUBER M J，TAUBER C A，MASAKI S. Seasonal adaptations of insect [M].Oxford：Oxford University Press， 1986：135-151.

[8] CROWE J H，CROWE L M，CHAPMAN D.Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms—the role of trehalose [J].Science，1984，223（4637）：701-703.

[9] BENAROUDJ N，LEE D H，GOLDBERG A L. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals [J].Journal of Biological Chemistry，2001，276（26）：24261-24267.

[10]FIELDS P G，F(xiàn)LEURAT-LESSARD F，LAVENSEAU L，et al.The effect of cold acclimation and deacclimation on cold tolerance，trehalose and free amino acid levels in Sitophilus granarius and Cryptolestes ferrugineus （Coleoptera） [J].Journal of Insect Physiology，1998，44（10）：955-965.

[11]JAIN N K，ROY I.Effect of trehalose on protein structure [J].Protein Science，2009，18（1）：24-36.

[12]THOMPSON S N. Trehalose-the insect ‘blood sugar [J].Advances Insect Physiology，2003，31：205-285.

[13]WEGENER G. Flying insects： model systems in exercise physiology [J].Experientia，1996，52（5）：404-412.

[14]CHEN Jie，TANG Bin，CHEN Hongxin，et al. Different functions of the insect soluble and membrane-bound trehalase genes in chitin biosynthesis revealed by RNA interference [J/OL].PLoS ONE，2010，5（4）：e10133. DOI： 10.1371/journal.pone.0010133.

[15]SHUKLA E，THORAT L J，NATH B B，et al.Insect trehalase： physiological significance and potential applications [J].Glycobiology，2015，25（4）：357-367.

[16]YANG Mengmeng，ZHAO Lina，SHEN Qida，et al.Knockdown of two trehalose-6-phosphate synthases severely affects chitinmetabolism gene expression in the brown planthopper Nilaparvata lugens [J].Pest Management Science，2017，73（1）：206-216.

[17]徐衛(wèi)華.昆蟲滯育的研究進(jìn)展[J].昆蟲學(xué)報(bào)，1999，42（1）：100-107.

[18]柯勇.柑桔大實(shí)蠅的越冬生物學(xué)研究[D].荊州：長(zhǎng)江大學(xué)，2013.

[19]李志剛，韓詩(shī)疇，郭明昉，等.取食不同食料植物對(duì)安婀珍蝶的營(yíng)養(yǎng)利用及中腸四種酶活力的影響[J].昆蟲學(xué)報(bào)， 2005，48（5）：674-678.

[20]NEGM F A，LOESCHER W H.Detection and characterization of sorbitol dehydrogenase from apple callus tissue [J].Plant Physiology，1997，64（1）：69-73.

[21]王佳，樊歡，熊克才，等.柑橘大實(shí)蠅滯育和非滯育蛹體內(nèi)海藻糖含量的調(diào)控[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2018，61（9）：1010-1018.

[22]KLOWDEN M J.Metabolic systems in physiological systems [M].London：Academic Press，Elsevier Inc，2007：293-356.

[23]AYYANGAR G S G，RAO P J.Changes in haemolymph constituents of Spodoptera litura （Fabr.） under the influence of azadirachtin [J].Indian Journal of Entomology，1990，52（1）：69-83.

（責(zé)任編輯：田 喆）