哈茨木霉重組株L-15與野生株LTR-2貯存穩(wěn)定性及生防活性研究

陳凱　李紀(jì)順　王貽蓮　魏艷麗　扈進冬　楊合同

摘要 為比較哈茨木霉重組株L-15與野生株LTR-2在貯存穩(wěn)定性及生防活性方面的差異，采用平板菌落計數(shù)法檢測木霉可濕性粉劑中分生孢子的存活率，測定菌株的生物學(xué)特性，并在溫室條件下評價制劑對番茄立枯病的防治效果。結(jié)果表明，分生孢子存活率達80.0%時，在5℃和室溫（2℃～36℃）下，L-15可濕性粉劑的貨架期分別為24個月和9個月，顯著高于LTR-2可濕性粉劑的12個月和6個月。L-15的潮霉素抗性在貯存后穩(wěn)定遺傳，其β-1， 4-葡聚糖酶水解活性、幾丁質(zhì)酶水解活性及平板拮抗活性較LTR-2明顯提高。5℃貯存60月后，L-15可濕性粉劑10×和100×稀釋處理對番茄立枯病的溫室防治效果分別達89.27%和86.52%，與LTR-2處理間存在極顯著性差異（P<0.01）。重組株L-15的貨架期和生防活性較野生株LTR-2明顯提高，在生物防治領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞 哈茨木霉重組株L-15; 哈茨木霉野生株LTR-2; 可濕性粉劑; 貨架期; 番茄立枯病; 防治效果

中圖分類號：

S 476

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019223

Storage stability and biocontrol efficiency of Trichoderma harzianum recombinant strain L-15 and wild strain LTR-2

CHEN Kai， LI Jishun*， WANG Yilian， WEI Yanli， HU Jindong， YANG Hetong

（Institute of Ecology， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），

Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology， Jinan 250103， China）

Abstract

To compare storage stability and biocontrol efficiency between Trichoderma harzianum recombinant strain L-15 and wild strain LTR-2， the conidiospore survival rate of wettable powder during storage period was determined by using plate colony counting method; biological characteristics of both strains were investigated， and the biocontrol efficiency of wettable powder against tomato Rizoctonia rot was evaluated under greenhouse conditions. The results demonstrated that， when the survival rate of conidiospores was maintained at 80.0%， the shelf life of L-15 wettable powder reached 24 and 9 months at 5℃ or room temperature （2℃-36℃）， respectively， which were significantly higher than those of LTR-2 wettable powder （12 and 6 months， respectively）. The hydrolytic activity of β-1，4-glucanase and chitinase in L-15 and its antagonistic activity on plate were obviously enhanced compared to LTR-2， and the introduced hygromycin resistance of L-15 was also stably inherited over storage period. Under greenhouse conditions， the biocontrol efficiencies against tomato Rizoctonia rot of 10 and 100-times dilution of L-15 wettable powder after 60 months at 5℃ were 89.27% and 86.52%， respectively， which were significantly different from LTR-2 wettable powder （P<0.01）. In summary， T.harzianum recombinant strain L-15 had an improved storage stability and biocontrol efficiency compared with wild strain LTR-2 and thus has a potential for biocontrol application.

Key words

Trichoderma harzianum recombinant strain L-15; Trichoderma harzianum wild strain LTR-2; wettable powder; shelf life; tomato Rizoctonia rot; biocontrol efficiency

木霉Trichoderma spp.是自然界廣泛分布的生防真菌，自1932年Weindling[1]發(fā)現(xiàn)木霉的拮抗作用后，國內(nèi)外專家、學(xué)者在木霉生防和應(yīng)用方面做了大量工作，表明木霉具有多種生防機制：可在多種逆境下生存和定殖、有效利用環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)、抑制植物病害發(fā)生、促進植物生長和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[2-4]。木霉至少對18個屬20余種病原真菌和多種病原細菌有拮抗作用，目前國際上有60多個國家使用100多種含有木霉成分的生物制劑產(chǎn)品[5]。

雖然自1960年木霉的生物防治功能被世界關(guān)注，但其商品化進程仍存在諸多問題：主要是缺乏合適的劑型，田間應(yīng)用效果不理想以及制劑保質(zhì)期短[6]。據(jù)報道，以滑石粉、草炭、褐煤以及高嶺土為載體，木霉制劑的保質(zhì)期只有3～8個月[7-9]。以液體石蠟為載體，15～35℃保存6個月，木霉孢子存活率為22.4%;4℃保存11個月，木霉孢子存活率僅為8.8%[10]。在去離子水中保存1年，木霉孢子存活率為75%;2年則為60%[11]。微膠囊是目前保存效果較好的木霉劑型，但12～14個月后，微膠囊中孢子含量也只有106 cfu/g[6， 12]，且微膠囊制備工藝較復(fù)雜，應(yīng)用效果不理想，生產(chǎn)成本較高。

2016年公布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2888.1-2016和NY/T 2888.2-2016規(guī)定：木霉制劑5℃保存12個月或20～25℃保存6個月，貯存穩(wěn)定性不低于80%[13-14]，現(xiàn)有木霉制劑很難達到標(biāo)準(zhǔn)要求。為解決上述問題，應(yīng)加大木霉研發(fā)力度，構(gòu)建具有抗逆、拮抗能力和誘導(dǎo)抗性強的廣譜生防工程菌株;建立高密度、低成本、無污染的規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)工藝;并重點解決活菌制劑的貯存問題[15-16]。

凹凸棒土（attapulgite）是一種具鏈層狀結(jié)構(gòu)的含水富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，利用凹凸棒土為載體制備的微生物制劑保質(zhì)期長，在土壤中釋放緩慢，從而延長藥效，降低生產(chǎn)成本[17-18]。本文以前期得到的廣譜高效木霉重組株L-15為研究對象，以凹凸棒土為載體制備木霉的可濕性粉劑，探索基因重組后對木霉制劑貯存穩(wěn)定性的影響，并評價其貯存后的生防效果，為進一步推廣應(yīng)用及商品化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

哈茨木霉T.harzianum野生株LTR-2，本實驗室分離保存，具有多種生防活性，無潮霉素hygromycin抗性[19]。哈茨木霉重組株L-15，系以LTR-2為出發(fā)菌株，利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)法構(gòu)建而成，包含外源β-1，4-葡聚糖酶基因glu14和幾丁質(zhì)酶基因chi42，具有潮霉素抗性（Hyg 200 μg/mL）[20]。

指示菌為本室保存的13種植物病原真菌：致病疫霉Phytophthora infestans、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、大麗輪枝菌Verticillium dahliae、平臍蠕孢Helminthosporium sativum、白腐盾殼霉Coniothyrium diplodiella、尖鐮孢萎蔫專化型Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum、串珠鐮孢F.moniliforme、木賊鐮孢F.equiseti、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、小葡萄座腔菌B.parva、禾谷絲核菌Rhizoctonia cerealis、立枯絲核菌R.solani。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

潮霉素B（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇寶靈化工股份有限公司），番茄品種為‘粉番茄（濟南大江種子有限公司）。

1 mg/mL剛果紅：1 g剛果紅溶于1 L蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1 mol/L NaCl：58.5 g NaCl溶于1 L蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

PDAT培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中添加Triton X-100 0.5 mL/L。

PDAH培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中添加Hyg 200 μg/mL。

PDAHT培養(yǎng)基：PDAH培養(yǎng)基中添加Triton X-100 0.5 mL/L。

小麥培養(yǎng)基：小麥種子用自來水室溫浸泡24 h，除去石子雜草等，瀝干水分，分裝250 mL組培瓶，121℃滅菌1 h備用。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、（NH4）2SO4 1 g、K2HPO4 1.36 g、膠體幾丁質(zhì)10 g、瓊脂15 g、Triton X-100 0.5 mL、蒸餾水1 000 mL。

CMCNa培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g、KH2PO4 15 g、（NH4）2SO4 5 g、CaCl2 0.6 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、MnSO4·H2O 0.001 6 g、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g、CoCl2·6H2O 0.003 7 g、CMCNa（羧甲基纖維素鈉）5 g、瓊脂15 g、Triton X-100 0.5 mL、蒸餾水1 000 mL。

1.3 木霉可濕性粉劑制備

分別在PDA和PDAH培養(yǎng)基平板上活化木霉重組株L-15和野生株LTR-2，培養(yǎng)完畢后刮取分生孢子制備孢子懸浮液107cfu/mL，按1%接種量接種滅菌的小麥培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)4 d至分生孢子布滿整個培養(yǎng)基，用無菌生理鹽水洗脫分生孢子，7 000 r/min離心10 min后收集分生孢子備用。

凹凸棒土提前于180℃烘干2 h，以其為載體制備L-15和LTR-2的可濕性粉劑：凹凸棒土95%、葡萄糖0.5%、黃原膠0.25%、十二烷基苯磺酸鈉0.25%、羧甲基纖維素鈉0.5%，幾丁質(zhì)0.5%，分生孢子3%?？蓾裥苑蹌┏跏蓟罘稚咦雍坎坏陀?0億/g，制劑含水量控制在5%左右。

1.4 木霉可濕性粉劑貯存穩(wěn)定性檢測

將混合均勻的上述可濕性粉劑分裝在小型鋁箔袋中，每袋10 g，用塑料薄膜封口機封口，分別置于5℃和室溫（2～36℃）貯存，間隔3個月取樣1次，每種制劑3袋重復(fù)，采用稀釋涂布平板法檢測可濕性粉劑中的活分生孢子含量，計算存活率，L-15檢測培養(yǎng)基為PDAHT，LTR-2檢測培養(yǎng)基為PDAT。

孢子存活率%=c/c0×100%;

其中c為不同貯存期可濕性粉劑的活孢子數(shù)，c0為可濕性粉劑的初始活孢子數(shù)。

1.5 木霉重組株L-15和野生株LTR-2的生物學(xué)特性

1.5.1 木霉菌株潮霉素抗性及培養(yǎng)特性檢測

生物學(xué)特性測定用木霉重組株L-15來自5℃下貯存60個月的L-15可濕性粉劑，野生株LTR-2來自

-80℃超低溫冰柜保存菌種。分別在PDAH和PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)L-15和LTR-2，觀察其生長速率及產(chǎn)孢性能，檢測貯存60個月后L-15中潮霉素基因的遺傳穩(wěn)定性。

1.5.2 基因重組對L-15水解酶活性的影響

在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和CMCNa培養(yǎng)基上接種1.5.1中分離到的L-15和LTR-2，25℃培養(yǎng)6 d后，CMCNa平板先用1 mg/mL剛果紅染色20 min，再用1 mol/L NaCl沖洗2次，觀察水解圈大小;幾丁質(zhì)平板直接觀察水解圈大小。

1.5.3 基因重組對L-15抑菌活性的影響

利用對峙培養(yǎng)法測定1.5.1中L-15和LTR-2對供試植物病原真菌的抑菌活性，用直徑5 mm打孔器打取木霉與病原真菌菌落邊緣的菌絲塊，然后對接在PDA平板兩端，兩個菌塊相距70 mm，以只接種病原真菌為對照，25℃對峙培養(yǎng)6 d，觀察兩者之間的拮抗情況，計算抑制率。

抑制率=（r02-r2）/r02×100%;

其中r0為對照病菌生長半徑，r為與木霉對峙培養(yǎng)的病菌生長半徑。

1.6 木霉可濕性粉劑對番茄立枯病的溫室防治效果

生防菌劑為5℃貯存60個月的L-15可濕性粉劑（分生孢子含量為2.0億/g）;對照菌劑為新配制的LTR-2可濕性粉劑，分生孢子含量調(diào)整為2.0億/g。每種菌劑設(shè)3個稀釋梯度：10×、100×及1 000×稀釋，試驗設(shè)8個處理：L-15/10×、L-15/100×、L-15/1 000×、LTR-2/10×、LTR-2/100×、LTR-2/1 000×、多菌靈/800×、清水對照。每處理3個重復(fù)。

利用小麥培養(yǎng)基培養(yǎng)病原真菌R.solani，待菌絲布滿麥粒后，按1 g/kg的劑量均勻混入健康大田土中，制成帶病盆栽土，分裝干凈花盆。番茄在育苗缽中提前育苗，選取生長健壯、大小適中的幼苗進行移栽，每盆10株，每處理3盆，分別用上述不同濃度處理菌劑及多菌靈灌根500 mL/盆。

在人工氣候室內(nèi)于光周期為L∥D=10 h∥14 h，晝夜溫度為25/18℃，空氣相對濕度為50%～70%的條件下，對盆栽樣品進行栽培管理。28 d后進行番茄立枯病病害調(diào)查，統(tǒng)計防治效果。

立枯病病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，全株無病;1級，莖基部有小病斑，占莖圍的25%以下;2級，莖基部病斑較大，約占莖圍的25%～50%;3級，莖基部病斑較大，約占莖圍的50%以上，但尚未破壞整個莖圍;4級，莖基部病斑占據(jù)全部莖圍，植株死亡。

病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×相對病級數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×4）×100;

防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行Duncan氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉可濕性粉劑的貯存結(jié)果

木霉重組株L-15和野生株LTR-2可濕性粉劑中初始活分生孢子含量均為10.0億/g，制劑含水量5.5%，在10-6數(shù)量級上未檢出雜菌，制劑貯存結(jié)果見圖1。在室溫（2～36℃）和5℃兩種貯存條件下，可濕性粉劑中分生孢子存活率均隨時間的延長呈降低趨勢，5℃貯存效果好于室溫。室溫下，LTR-2貯存21個月基本檢測不到分生孢子（孢子存活率<5.0%），L-15貯存30個月基本檢測不到分生孢子。5℃下，LTR-2貯存39個月基本檢測不到分生孢子，L-15貯存結(jié)果較

好，至72個月才基本檢測不到分生孢子。重組株L-15可濕性粉劑在兩種條件下的貯存穩(wěn)定性均好于野生株LTR-2。

以分生孢子存活率80.0%、50.0%和20.0%為檢測指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)不同處理可濕性粉劑對應(yīng)的貯存期不同。在5℃條件下：L-15的貯存期分別為24、39和60個月;LTR-2的貯存期分別為12、18和30個月。在室溫條件（2～36℃）下：L-15的貯存期分別為9、15和21個月;LTR-2的貯存期分別為6、9和15個月。另外，5℃下L-15貯存3月內(nèi)分生孢子存活率達100.0%，結(jié)果見表1。按中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2888.2-2016貯存穩(wěn)定性的要求，LTR-2可濕性粉劑基本達到標(biāo)準(zhǔn)要求，L-15可濕性粉劑明顯高于標(biāo)準(zhǔn)，5℃下貨架期可達24個月。

2.2 木霉重組株L-15和野生株LTR-2的生物學(xué)特性

2.2.1 木霉菌株的潮霉素抗性及培養(yǎng)特性

野生株LTR-2對潮霉素敏感，在PDAH培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d不生長，在PDA培養(yǎng)基上生長速率為21 mm/d，培養(yǎng)5 d后75%的平板上布滿分生孢子。

從5℃下貯存60個月的木霉重組株L-15可濕性粉劑中分離得到的L-15，接種PDA和PDAH培養(yǎng)基后，25℃下生長速率分別為23 mm/d和22 mm/d，培養(yǎng)5 d后分生孢子產(chǎn)量略高于LTR-2，L-15在兩種培養(yǎng)基上的生長速率和產(chǎn)孢情況差別不大，在PDA上的產(chǎn)孢量相對稍多，結(jié)果見圖2，說明貯存后L-15仍具有潮霉素抗性及遺傳穩(wěn)定性。

2.2.2 基因重組對L-15水解酶活性的影響

野生株LTR-2本身有一定的β-1，4-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶水解活性，但水解圈不明顯，而木霉重組株L-15的兩種水解酶活性較LTR-2明顯提高，水解圈較大，結(jié)果見圖3。

2.2.3 基因重組對L-15抑菌活性的影響

木霉重組株L-15和野生株LTR-2在PDA平板上對供試的13種植物病原真菌均有拮抗作用，L-15的拮抗效果較好，對同一種病原真菌的抑制率較LTR-2均有所提高。L-15對P.infestans、

F.oxysporum、F.moniliforme、V.dahliae、R.cerealis、P.aphanidermatum及R.solani的抑制率與LTR-2存在極顯著性差異（P<0.01），L-15對B.cinerea、B.parva、F.equiseti及C.diplodiella的抑制率與LTR-2存在顯著性差異（P<0.05），結(jié)果見圖4。說明通過基因重組，增強了L-15的抗菌活性。

2.3 木霉可濕性粉劑對番茄立枯病的溫室防治效果

木霉重組株L-15可濕性粉劑5℃下貯存60個月，制劑中活分生孢子含量為2.0億/g，貯存后L-15制劑對番茄立枯病的溫室防治效果見表2，不同處理間病情指數(shù)差異較大，各處理組的病情指數(shù)與清水對照間存在極顯著性差異（P<0.01），其中L-15/10×和L-15/100×兩組處理的病情指數(shù)與其他處理間也存在極顯著性差異（P<0.01），對番茄立枯病的防治效果分別達到了89.27%和86.52%，但兩者間無顯著性差異。

木霉重組株L-15可濕性粉劑為5℃貯存60個月，野生株LTR-2可濕性粉劑為新配制，同一稀釋度的L-15與LTR-2處理間均存在極顯著性差異（P<0.01），說明在有效活孢子數(shù)相同的情況下，重組菌株L-15的生防效果明顯好于野生株LTR-2，貯存后不影響重組株的活性。

3 討論

木霉是一類重要的生防菌，產(chǎn)品貨架期短和防治效果不穩(wěn)定是制約木霉推廣應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。為了研發(fā)貨架期長、生防性能高的木霉制劑，本文利用木霉重組株L-15制備可濕性粉劑，貯存結(jié)果表明，制劑中分生孢子存活率不低于80.0%時，室溫貯存期為9個月，5℃下為24個月;而野生株LTR-2可濕性粉劑分生孢子存活率不低于80.0%時，室溫貯存期為6個月，5℃下為12個月。L-15可濕性粉劑在5℃下延長貯存期至60個月，分生孢子存活率不低于20.0%。木霉重組株L-15可濕性粉劑的貯存結(jié)果明顯好于野生株LTR-2，高于前人報道的分生孢子制劑的保質(zhì)期限[7-9， 21-22]，也好于張晶晶和Mishra等研制的厚垣孢子制劑[23-24]。室溫下貯存期短的原因可能是溫度范圍變化較大（2～36℃），且高溫期較長，在高于25℃的高溫下孢子自身消耗嚴(yán)重。木霉重組株L-15的貯存穩(wěn)定性較野生株LTR-2明顯提高，推測原因可能是外源基因的隨機插入，導(dǎo)致了某些基因位點發(fā)生突變，分生孢子壁結(jié)構(gòu)與組成更穩(wěn)固，進而較野生株LTR-2更耐貯存，具體原因有待進一步探討。

木霉重組株L-15具有外源β-1，4-葡聚糖酶基因glu14和幾丁質(zhì)酶基因chi42，可有效降解病原真菌的細胞壁，抑菌活性測定結(jié)果表明，L-15對供試病原真菌的抑制率均高于LTR-2。溫室條件下，在有效活孢子數(shù)相同的情況下，L-15制劑對番茄立枯病的生防效果明顯好于LTR-2，貯存后不影響重組菌株的活性。兩組處理L-15/10×和L-15/100×對番茄立枯病的防治效果較好，與其他處理間存在極顯著性差異（P<0.01），但兩者間無差異，綜合成本和防效考慮，L-15可濕性粉劑的分生孢子含量為2.0億/g時，灌根時以稀釋100×為最優(yōu)選使用劑量。

截至2018年4月，我國已登記注冊的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品509個，其中木霉15個，占比只有2.9%[25]，與歐美發(fā)達國家相比差距較大。原因除政策因素和企業(yè)因素外，與生物農(nóng)藥產(chǎn)品自身的特點有很大的關(guān)系，主要缺點是產(chǎn)品見效慢、防治譜窄、抗逆性（如高溫、干燥、紫外輻射等）和耐貯性（常溫1年以上）差[3]。故應(yīng)加大研發(fā)力度，選育廣譜高效木霉菌株，研制適合商品化生產(chǎn)的木霉制劑。本文從基因重組的角度對木霉的貨架期和防效進行研究，為制劑研制提供了科學(xué)依據(jù)。下一步將對木霉重組株L-15進行安全性評價，爭取高效重組菌株的進一步應(yīng)用推廣。

參考文獻

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