小檗堿和Wnt/β-catenin信號通路抑制劑對胃癌細胞MKN45增殖凋亡及糖代謝影響研究?

張世霞，李聚林，馮五金

(1. 山西中醫藥大學,山西 晉中 030619； 2. 山西省中醫院,太原 030012)

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率。目前，放療、化療等治療方式在一定程度上提高了胃癌患者的生存率，但常規的化療藥物存在易復發、毒副作用大等缺點[1]。中國傳統的中草藥具有廣泛的藥用價值，且具有安全、高效、副作用低等優點，是抗腫瘤藥物的研究熱點之一[2]。小檗堿是中藥黃柏、黃連的主要成分，又名黃連素，具有消炎、降血脂、抗氧化等作用[3]。研究顯示，小檗堿可通過抑制腫瘤細胞生長、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡等發揮抗腫瘤作用[4-5]。Wnt/β-catenin信號通路是一種重要的細胞內信號傳導通路，在機體正常生理功能維持和疾病發生中均有調控功能[6]。Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤中異常激活，其關鍵蛋白β-catenin和下游靶基因c-myc過度表達，抑制其激活后可通過影響腫瘤細胞的生物學特性抑制腫瘤的發生發展[7-8]。研究報道稱，小檗堿可抑制結腸癌等癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路激活，二者之間可能存在一定聯系[9]。本研究旨在明確小檗堿和Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞MKN45增殖、凋亡及糖代謝的影響，為小檗堿和Wnt/β-catenin信號通路抑制劑治療胃癌提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗試劑

胃癌細胞(MKN45，美國ATCC)；胎牛血清(杭州四季青)；青霉素、RPMI1640培養基、鏈霉素、噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT，美國Sigma)；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved Caspase-3)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、單克隆抗體、β-連環蛋白(β-catenin)抗體、c-myc抗體(美國Abcam)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)，蛋白定量試劑盒 (PA115，北京TIANGEN)；細胞總蛋白抽提試劑盒(P1250，北京普利萊)；乳酸含量檢測試劑盒(南京森貝伽)；丙酮酸激酶活性檢測試劑盒(武漢艾美捷)；己糖激酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶)；膜聯蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium Iodide,PI)凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物公司)。

1.2 細胞培養

MKN45細胞從液氮中取出后37 ℃快速溶解，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養液，于飽和濕度、5% CO2的培養箱中培養。細胞生長密度超過80%以后吸棄上清液，0.25%胰蛋白酶消化后以1∶2的比例進行傳代，繼續培養用于后續實驗。

1.3 小檗堿對MKN45細胞增殖影響

MKN45細胞培養至對數期后，接種于96孔細胞培養板中，每孔2000個細胞。培養過夜后棄培養液，分別加入含小檗堿終濃度0、6、12、24、48和96 μmol/L的細胞培養液，每個濃度設置5個復孔。繼續培養48 h后加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養箱中繼續孵育4 h。棄上清液每孔加入150 μL二甲基亞砜，充分溶解結晶物后混合均勻，于酶標儀492 nm波長處測定吸光度值(absorbance,A值)，計算半數抑制濃度(half maximal inhibitory concertration,IC50)，實驗重復3次取均值。

1.4 細胞分組

MKN45細胞分為對照組、小檗堿組、FH535組和聯合組。小檗堿組終濃度24 μmol/L小檗堿作用于MKN45細胞48 h；FH535組20 μmol/L Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535作用于MKN45細胞48 h；聯合組24 μmol/L小檗堿與20 μmol/L FH535共同作用于MKN45細胞48 h，對照組中不加任何藥物。

1.5 細胞凋亡檢測

細胞分組培養后，胰蛋白酶消化，PBS清洗細胞并調整濃度為6×105個/mL。吸取1 mL細胞懸浮液，1000rpm離心10 min。棄上清液，加入200 μL結合緩沖液重懸細胞。再依次加各5 μL的碘化丙啶(propidium Iodide,PI)和膜聯蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)，室溫避光孵育15 min，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次取均值。

1.6 糖酵解水平檢測

細胞分組培養后收集細胞及培養液上清，用乳酸含量檢測試劑盒檢測上清中的乳酸水平，用丙酮酸激酶活性檢測試劑盒和己糖激酶活性檢測試劑盒分別檢測細胞中的丙酮酸激酶和己糖激酶活性。用實驗組與對照組的比值作為乳酸相對含量、丙酮酸激酶相對活性和己糖激酶相對活性，實驗重復3次取均值。

1.7 β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平檢測

細胞蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取適量蛋白樣品加入等體積的上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。5%濃縮膠和12%分離膠進行蛋白電泳。電泳后轉膜，37 ℃、5%脫脂奶粉孵育1 h。然后分別加入β-catenin(稀釋度1∶500)、c-myc(稀釋度1∶800)、Cleaved Caspase-3(稀釋度1∶600)抗體，4 ℃孵育過夜。次日加入二抗(稀釋度1∶2000)，37 ℃孵育反應1 h。加入ECL顯影，采用Bio-Rad采集圖像。以GAPDH為參照，Quantity One軟件分析蛋白表達水平，實驗重復3次取均值。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 小檗堿對MKN45細胞增殖的影響

表1示，與未使用小檗堿作用的MKN45細胞比，小檗堿作用MKN45細胞后吸光度值明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，表明小檗堿可劑量依賴性地抑制MKN45細胞增殖。經計算小檗堿作用MKN45細胞的IC50值為(24.38±2.81)μmol/L，因此選用24 μmol/L的小檗堿用于后續實驗。

表1 小檗堿作用后MKN45細胞A值變化比較

2.2 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑對MKN45細胞增殖的影響

表2示，與對照組比較，小檗堿組、FH535組、聯合組細胞A值均顯著降低(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯合組細胞A值顯著降低(P<0.05)，表明小檗堿和抑制Wnt信號通路均能夠抑制MKN45細胞增殖，且二者具有協同作用。

表2 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑作用后MKN45細胞A值變化

2.3 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑對MKN45細胞凋亡的影響

圖1表3示，與對照組比較，小檗堿組、FH535組、聯合組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯合組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，表明小檗堿和抑制Wnt信號通路均能促進MKN45細胞凋亡，且二者具有協同作用。

圖1 流式細胞術檢測MKN45細胞凋亡

表3 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑作用后MKN45細胞凋亡率變化比較

2.4 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑對MKN45細胞糖酵解的影響

表4示，與對照組比較，小檗堿組、FH535組、聯合組細胞丙酮酸激酶、己糖激酶及乳酸相對含量均顯著降低(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯合組細胞丙酮酸激酶、己糖激酶及乳酸相對含量均顯著降低(P<0.05)，表明小檗堿和抑制Wnt信號通路均能抑制MKN45細胞糖酵解，且二者具有協同作用。

2.5 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑對胃MKN45細胞β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平的影響

表4 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑作用后MKN45細胞糖酵解相關指標變化比較

圖2表5示，與對照組比較，小檗堿組、FH535組、聯合組MKN45細胞β-catenin和c-myc蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯合組MKN45細胞β-catenin和c-myc蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，表明小檗堿能夠抑制MKN45細胞中Wnt信號通路的激活，促進Caspase-3活化。

圖2 Western blot檢測β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平

表5 小檗堿和Wnt信號通路抑制劑作用后MKN45細胞β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平變化比較

3 討論

小檗堿常用來治療胃腸道疾病，具有較長的用藥歷史。隨著研究的深入發現，小檗堿可通過抑制細胞增殖、干擾細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制細胞轉移等發揮抗腫瘤作用[10]。研究顯示，不同濃度的小檗堿作用胃癌細胞后可抑制胃癌細胞增殖，并誘導其凋亡[11-12]。本研究結果顯示，小檗堿作用后，胃癌細胞增殖活性下降，凋亡率升高。這與之前的研究報道結果一致。

Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤發展有關，在腫瘤細胞增殖、凋亡等過程中具有重要作用。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調控蛋白，在腫瘤中表達下調[13]。Wnt的配體、卷曲蛋白、低脂密度蛋白相關受體可以特異性地結合形成復合物，激活Wnt/β-catenin信號通路，促使散亂蛋白磷酸化，抑制β-catenin磷酸化，而未被磷酸化的β-catenin不能與蛋白復合物特異性識別，從而導致β-catenin進入到細胞核，促進下游靶基因c-myc的表達[14-16]。何百成等[17]通過運用嵌合體報告質粒發現，小檗堿可以抑制細胞中β-catenin的激活。本研究結果顯示，Wnt/β-catenin信號通路抑制劑可抑制胃癌細胞生長，促進胃癌細胞凋亡。小檗堿或Wnt/β-catenin信號通路抑制劑均可降低胃癌細胞中β-catenin和c-myc表達，且兩者聯合作用效果更明顯，提示小檗堿通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮抗腫瘤作用。

癌細胞具有與正常細胞不同的能量代謝途徑，正常細胞只有在缺氧條件下通過糖酵解途徑供能，而腫瘤細胞無論是在氧氣充足還是氧氣不足的條件下都優先以糖酵解方式進行能量代謝，這被稱之為“有氧糖酵解”[18-20]。己糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的關鍵限速酶，其活性越高糖酵解速度越快[21]。乳酸是糖酵解的產物之一，檢測其含量的高低可以間接反映細胞內糖酵解水平[22]。研究顯示，小檗堿可以抑制乳腺癌細胞能量代謝水平，Wnt/β-catenin影響胰腺癌細胞糖酵解水平[23-24]。本研究表明，小檗堿或Wnt/β-catenin信號通路抑制劑作用后胃癌細胞中己糖激酶、丙酮酸激酶活性均降低，培養液上清中乳酸含量也降低，表明小檗堿或Wnt/β-catenin信號通路抑制劑可降低胃癌細胞糖酵解水平，且二者聯合作用效果更好，提示小檗堿通過抑制Wnt/β-catenin信號通路干擾胃癌細胞糖酵解。

總之，小檗堿和Wnt/β-catenin信號通路抑制劑均能抑制胃癌細胞增殖和糖酵解，促進細胞凋亡，二者聯合后抗腫瘤作用更為明顯。此外，小檗堿可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活發揮作用，為其用于胃癌的治療提供理論依據。