Caspase抑制劑對特應性皮炎患者外周血CD4+T細胞亞群分泌細胞因子的影響

李圓圓 郝寶珍 孟云芳

1山東第一醫科大學附屬省立醫院皮膚科，山東濟南，250021；2山東省婦幼保健院，山東濟南，250014

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種反復發作并伴有劇烈瘙癢的慢性炎癥性皮膚疾病。關于AD的發病機制目前尚未完全明了，T細胞介導的異常免疫反應對AD的發生發展可能起主要作用[1，2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylaspirate-specific proteinases, caspases)是細胞凋亡過程中的重要因子，近年發現，該家族部分成員(尤其是caspase-3及caspase-8)在T細胞活化與增殖中亦發揮重要作用[3,4]，有可能成為免疫性及炎癥性疾病新的治療方向。目前對caspase在炎癥性皮膚病中的研究較少。我們既往的研究表明，廣譜caspase抑制劑芐氧羧基-纈氨酰-丙氨酰-門冬氨酰氟甲基酮(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone, Z-VAD-FMK)可以抑制小鼠變應性接觸性皮炎[5,6]。有學者發現[7]，AD患者急性期皮損表皮角質形成細胞中caspase-3表達增加，但他們的研究結果局限在表皮內，沒有觀察真皮及血液內的淋巴細胞中caspases表達的情況，亦沒有用caspase抑制劑進行干預并觀察干預后的變化。本實驗以AD患者為對象，將廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK與患者外周血單一核細胞(blood mononuclear cells, PBMCs)體外共培養，研究caspase抑制劑在體外對AD患者T細胞免疫異常的影響。該研究將為從阻斷caspase方面來治療包括AD在內的免疫性及炎癥性皮膚病提供理論及實驗依據，為研制新型抗免疫及抗炎癥藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 對象 AD患者30例，其中男17例，女13例，年齡18～65歲，平均40.6歲，所有患者均符合Williams標準。在2周內未外用糖皮質激素類藥物及口服抗組胺藥物，4周內未系統應用糖皮質激素或免疫抑制劑治療。對照組30例均為本院體檢的健康成人，其中男18例，女12例，年齡22～60歲，平均38.5歲，無特應性疾病病史。兩組性別與年齡比較，其差異均無統計學意義。本研究通過本院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 Z-VAD-FMK購自美國Promega公司，使用時用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)稀釋。地塞米松購自美國Sigma公司，使用時用PBS稀釋。佛波酯和離子霉素購自美國Alexis公司，莫能霉素購自美國Sigma公司。PE-Cy5標記的抗人CD3單抗、FITC標記的抗人CD8單抗、PE標記的同型對照IgG1單抗購自美國BD公司。PE標記的抗人γ干擾素(IFN-γ)、人白細胞介素4(IL-4)、人白細胞介素17(IL-17)單抗購自美國eBioscience公司。人IFN-γ、IL-4、IL-17 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.2.2 主要儀器 流式細胞儀型號為FACSCalibur，系美國BD公司產品，ELISA檢測儀為美國BioTek公司產品。

1.3 方法

1.3.1 單一核細胞分離 取30例AD患者及30例健康對照肝素抗凝血5 mL，Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs，重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，調整細胞濃度至2×106/mL。

1.3.2 流式細胞儀檢測CD4+T細胞亞群 取上述PBMC懸液1 mL，接種于24孔板，加入佛波酯(終濃度50 μg/L)+離子霉素(終濃度1 mg/L)及莫能霉素(終濃度1 μmol/L)，37℃ 50 mL/L CO2培養箱中培養4 h。然后把細胞懸液移至1.5 mL離心管，1500 r/min離心5 min，棄上清，PBS溶液洗2次后進行流式細胞儀檢測。由于佛波酯可以減弱CD4的表達，本實驗未采用熒光素標記的CD4抗體，而用CD3+CD8-細胞群代替CD4+細胞群。

1.3.3 ELISA方法檢測培養上清液中的細胞因子 取上述PBMC懸液1 mL，接種于24孔板，將30例AD患者的PBMC均分3孔，每孔均加入佛波酯(終濃度50 μg/L)+離子霉素(終濃度1 mg/L)，然后再分別加入等量的Z-VAD-FMK溶液、地塞米松溶液及PBS溶液，使Z-VAD-FMK終濃度為100 μmol/L，地塞米松終濃度為250 nmol/L。置于37℃ 50 mL/L CO2培養箱中培養24 h。然后把細胞懸液移至1.5 mL離心管，1500 r/min離心5 min，收集上清液。ELISA方法檢測上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的濃度。

2 結果

2.1 AD患者外周血單一核細胞中Th1、Th2、Th17細胞比例 佛波酯+離子霉素刺激培養AD患者及健康對照PBMC 4 h后，用流式細胞術檢測細胞膜表面標記和細胞內細胞因子。結果顯示，AD患者組CD3+CD8-IFN-γ+(Th1)細胞比例低于健康對照組(P<0.01)，CD3+CD8-IL-4+(Th2)細胞比例明顯高于健康對照組(P<0.01)，CD3+CD8-IL-17+(Th17)細胞比例明顯高于健康對照組(P<0.01)。見表1、圖1。

1a、1c、1e:AD患者；1b、1d、1f:健康對照

表1 AD患者及健康對照組外周血表達不同細胞因子的CD4+T細胞亞群水平

2.2 Z-VAD-FMK對AD患者外周血單一核細胞培養上清液IFN-γ、IL-4、IL-17的影響 AD患者PBMCs中加入佛波酯+離子霉素刺激培養，然后再分別加入等量的Z-VAD-FMK溶液(終濃度100 μmol/L)、地塞米松溶液(終濃度250 nmol/L)及PBS溶液，培養24 h，ELISA方法檢測上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的濃度。結果顯示，與PBS處理組這一陰性對照相比，Z-VAD-FMK處理組與地塞米松處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平均顯著降低，差異均有統計學意義(均P<0.01)；與地塞米松處理組這一陽性對照相比，Z-VAD-FMK處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2、圖2。

表2 廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對特應性皮炎患者外周血單一核細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17的影響

圖2 Z-VAD-FMK對特應性皮炎患者外周血單一核細胞分泌細胞因子的影響

3 討論

特應性皮炎是一種慢性、反復發作的炎癥性皮膚病，主要癥狀有劇烈的瘙癢、廣泛的紅斑脫屑等濕疹樣皮損以及干皮癥等，嚴重影響患者及其家人的生活。在過去30年中，許多國家特應性皮炎的患病率大幅度增加。特應性皮炎的發病機制尚不明確，目前認為AD是遺傳、環境、皮膚屏障功能缺陷和免疫異常共同作用的多基因復雜疾病，CD4+T細胞介導的異常免疫反應一直是AD發病機制的研究熱點。以往多項研究表明，Th2細胞占優勢的Th1/Th2平衡失調是免疫介導的AD發生環節之一。Th17是新近發現的CD4+T細胞亞群，有研究顯示，AD患者外周血和皮損中Th17細胞數量均增多，其百分比與疾病本身的嚴重程度相關[8,9]。

在本實驗中，我們觀察了AD患者外周血單一核細胞中Th1、Th2、Th17細胞的比例，發現與健康對照相比，Th1細胞明顯下降，Th2與Th17細胞明顯升高，這與其他學者的研究結果一致[2,9]。

近年來的研究表明，caspases不僅參與細胞凋亡，其在T細胞增殖與活化中亦發揮著重要作用。主要體現在以下方面：T細胞體外活化過程中檢測到多種caspases的活性；caspase-8失活后導致了人與鼠T細胞免疫缺陷；體外實驗中，caspase抑制劑能阻斷抗CD3單抗、有絲分裂原及超抗原誘導的T細胞的增殖與活化。目前，關于在體內研究caspases在T細胞活化中的作用以及caspase抑制劑抗免疫反應的報道較少。Iwata等[10]將廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK應用于小鼠哮喘模型，他們發現，經尾靜脈注射Z-VAD-FMK進行干預后，小鼠氣道及肺血管中炎細胞浸潤明顯減少，黏液分泌及Th2細胞因子分泌也減少，T細胞在體外受到刺激后產生Th2細胞因子的能力也明顯下降。我們既往研究亦表明，外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK治療小鼠變應性接觸性皮炎(ACD)有一定的療效[5]，且可以抑制小鼠ACD的激發[6]。國內外尚未見到將其用于特應性皮炎的研究。

在本實驗中，我們以特應性皮炎患者為研究對象，進一步觀察了廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對AD患者PBMCs培養上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的影響。參照既往文獻報道[11]，Z-VAD-FMK的終濃度設為100 μmol/L，以PBS溶液為陰性對照，以250 nmol/L地塞米松溶液為陽性對照。結果發現，與陰性對照相比，Z-VAD-FMK處理組與地塞米松處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平均顯著降低。這提示，廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對AD患者外周血Th1、Th2、Th17等CD4+T細胞分泌相關細胞因子的能力均有抑制作用。本實驗還發現，與地塞米松處理組這一陽性對照相比，Z-VAD-FMK處理組IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差異均無統計學意義。這提示，廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對AD患者外周血CD4+T細胞的抑制作用與250 nmol/L地塞米松相似。

有研究發現[7]，AD患者急性期皮損表皮角質形成細胞中caspase-3表達增加，但他們的研究結果局限在表皮內，沒有觀察真皮內浸潤的淋巴細胞中caspases表達的情況，亦沒有用caspase抑制劑進行干預并觀察干預后的變化。在本實驗中，我們觀察了caspase抑制后對AD患者外周血CD4+T細胞的影響，今后可以對AD皮損中浸潤的淋巴細胞進行相關研究，并進一步應用至動物模型中。

雖然已在部分炎癥性疾病的動物實驗中觀察到caspase抑制劑抗免疫、抗炎癥的作用，但尚未進行臨床試驗，考慮可能與相關研究仍較少有關。今后需要進行更多的研究進一步加以驗證，為研制新型抗免疫及抗炎癥藥物提供依據。