基于UPLC/Q-TOF MS/MS的穩心顆粒主要成分分析及鑒定*

李曉鳳，張少強，劉金彪，裴麗敏，孫立麗，周 博，杜武勛

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250；2.天津理工大學，天津 300384；3.天津中醫藥大學，天津 301617；4.山東步長制藥股份有限公司，荷澤 274005）

中藥復方多靶點、多途徑的治療特點，與復方多靶點、多機制的病機特點相得益彰。心律失常是心血管領域常見、復雜疾病，惡性心律失常是心血管疾病重要致死因素。心律失常發病機制復雜，尤其是心律失常抑制（CAST）試驗表明單通道、單靶點的治療模式往往會帶來更加嚴重的心律失常事件。理想的抗心律失常藥物應對心臟多個離子通道靶點有作用，并且對每個通道的作用都比較溫和，不過度抑制某一個或幾個離子通道，并有益于離子通道之間平衡的恢復[1]。而中藥復方存在多靶點、多通道的特點與優勢，與心律失常理想治療原則不謀而合。以穩心顆粒為代表的中藥復方在抗心律失常方面療效顯著，且安全性高，臨床常用中成藥未見致心律失常等不良反應的報道，是理想的抗心律失常藥。穩心顆粒由黨參、黃精、三七、琥珀、甘松5味中藥組成，主要功效為活血化瘀、定悸復脈、益氣養陰，對心脈瘀阻所致的胸悶胸痛、氣短乏力、心悸不寧等癥狀有良好的治療效果。

國內外學者對穩心顆粒化學成分進行了相關研究，例如張家偉等[2]采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法測定大鼠灌服穩心顆粒后血漿中3個皂苷成分的濃度，并研究其藥物動力學特征。李啟艷等[3]用快速溶劑萃取-超高效液相色譜法測定穩心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量。柳江紅等[4]采用X射線衍射傅里葉指紋圖譜法，建立穩心顆粒制劑的鑒定分析新方法。但上述研究或集中于穩心顆粒某類單一成分（主要是皂苷類），并未對穩心顆粒全部成分進行分析；或未分析其具體成分。復方干預復雜疾病研究的基礎是明確復方藥效物質基礎，復方藥效整體藥物配伍組合的綜合效應，故本研究利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（UPLC/Q-TOF MS/MS）技術，分析穩心顆粒水溶液成分，并結合文獻報道，分析主要成分的藥效機制，從而篩選出穩心顆粒治療心律失常的藥效物質基礎。

1 主要儀器與試劑

Acquity TM UPLC液相儀（美國Waters公司），Synapt TM High DefinitionMS（HDMS）System 質譜儀（美國Waters公司），ACQUITYUPLCBEHC18（2.1mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱（美國 Waters公司），MIKRO 220RS/N0000346-01-00高速離心機（德國Hettich公司），色譜純乙腈（Fisher，美國，071757），甲醇（Fisher，美國，154449），甲酸（CNW，德國，3208K240）、純凈水（農夫山泉），穩心顆粒（山東步長制藥股份有限公司，批號：1805106）。

2 方法

2.1 穩心顆粒溶液制備 將穩心顆粒按0.5 g/10 mL溶于純凈水中，超聲溶解，離心半徑為87 mm，10 000 r/min離心10 min，得上清液。稀釋4倍后0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：45℃；室溫：4℃；流動相：乙腈（A）-水（B）（含體積比 0.1%甲酸），梯度洗脫（0 min，2%B；6 min，22%B；10 min，30%B；14～18 min，38%B；22 min，60%B；26～28 min，100%B；29～30 min，2%B）；進樣量：5 μL。

2.3 質譜條件 采用電噴霧電離源（ESI源），正離子（Positive）/負離子（Negative）雙模式檢測，ESI源溫度分別為 120℃（Positive）/110℃（Negative），脫溶劑和霧化氣為高純N2，錐孔N2反吹流量50L/h，電壓40 V；毛細管電壓 3.0 kV（Positive）/2.0 kV（Negative）；N2溫度 450 ℃（Positive）/280 ℃（Ngeative），流量800 L/h；分子量范圍50～1 200 Da；采樣頻率0.1 s，間隔0.02s；掃描時效30min；全信息串聯質譜（MSE）采集模式，碰撞能量25 V。LockMass采用亮氨酸-腦啡肽 LE，其 m/z為[M+H]+=556.277 1、[M-H]-=554.261 5，對檢測樣品分子量進行實時校正。

2.4 數據分析 采用WatersMassLynxV4.1軟件進行分析。

3 結果

穩心顆粒水溶液Positive/Negative模式下BPI圖，見圖1。經Waters MassLynxV4.1軟件分析，共鑒定68個化合物，其中有24個成分ppm≤3，見表1。

根據復方中各味中藥的名稱，查閱《中藥質量現代分析技術》、相關有效成分文獻報道，并參考TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及 PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），確定可能含有的每味中藥的有效成分，記錄下對應分子式。利用液質工作站自帶分子量計算軟件MassLynx，分別計算出有效成分的 M、M+H、M+Na、M-H、M+HCOOH精確分子量，如三七皂苷R1，M=932.534，[M+H]+=933.542 6，[M+Na]+=955.524 5，[M-H]-=931.526 9，[M+HCOO]-=977.532 4。在 MassLynx軟件中調用Positive液相色譜圖TIC格式，并轉換成BPI格式，利用分子量檢索功能提取正離下母離子峰，如三七皂苷R1為933.54和955.52，分子量提取窗口寬度為0.02。如果樣品液相圖譜中有目標化合物的母離子峰，就會在相應的出峰位置出現色譜峰，根據信號峰的強弱初步判斷是否有該化合物。采用相同方法對Negative模式下物質進行處理。如果色譜圖中有一個比較明顯的特征峰，Positive/Ngeative下出峰時間基本相同，兩者分子量相差2，基本可以確定是同一物質的Positive/Ngeative峰。根據二級質譜圖結合化合物結構式確定可能的離子碎片，推測化合物的裂解途徑。如果色譜圖中出現兩個或者兩個以上色譜峰，且分子量基本完全相同，結構式推測結果可能是同分異構體（三七藥材中含有較多同分異構體），根據二級質譜的碎片特征推測裂解途徑，或者根據相關數據庫、對照品及文獻檢索查看化合物的碎片，確定化合物結構。

4 討論

本研究首次利用UPLC/Q-TOF MS/MS技術，對穩心顆粒水溶液成分進行初步分析，共有效表征了該復方中68個化學成分，主要包括糖類、皂苷類、黃酮類、揮發油類，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1豐度較高。

本研究所鑒定的68個成分中，來自三七的30個成分主要屬于皂苷類。實驗研究顯示三七皂苷可直接抑制心肌作用，有效治療各種藥物誘發的心律失常[5]。三七皂苷、人參皂苷Rb1還具有鎮靜、鎮痛[6]、改善肝臟微循環[7]、延緩衰老[8]等作用。

有11個成分主要來源于甘松，其主要成分為揮發油和萜類成分，后者又以倍半萜種類最多，可以激活竇房結及周圍組織，清除代謝產物，抑制異位性室性期前收縮、損傷性心房撲動等快速性心律失常，其安全性高，毒副作用小[9]。甘松中丹參酮ⅡA可以抑制過表達的血清反應因子（SRF），抑制miR-1的過表達，恢復由于過表達miR-1抑制KCND2的表達，恢復Kv4.2蛋白的表達，改善鉀通道功能紊亂[10]。

有16個成分主要來源于黃精，主要含糖類、氨基酸及多種黃酮類、蒽醌類化合物，具有強心、提高免疫力[11-12]、抗衰老[13]、降低血脂、降低血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[14-16]。有研究顯示其最具心血管活性的物質為一些苷類及苷元[17]，如（+）-松脂素-O-β-D-吡喃葡糖糖基（1→6）-β-D-吡喃葡糖糖苷、（+）-丁香脂素-O-β-D-吡喃葡糖糖苷、滇黃精苷A、滇黃精苷C等，可抗動脈粥樣硬化。

圖1 UPLC/Q-TOF MS/MS Positive/Negative模式下一級總離子流圖譜（BPI）Fig.1 Primary total ion flow diagram(BPI)in UPLC/Q-TOF MS/MS Positive/Negative ion mode

有16個成分主要來源于黨參，黨參具有抗氧化作用[18]，而冠心病等心腦血管疾病與缺氧有關，顯示黨參在心腦血管疾病的治療上有應用前景[19]。

綜上，甘松有著直接抗心律失常作用，在穩心顆粒抗心律失常作用中為君藥。本研究中所檢測出的主要成分為皂苷類成分，主要源自三七，是抗心律失常、保護心血管系統的重要物質基礎，故三七為臣藥。穩心顆粒抗心律失常作用與黃精強心、提高免疫力、抗氧化、抑制炎癥等藥理作用以及黨參的抗氧化、增強心肌耐氧作用、抗炎等藥理作用密切相關，兩者乃佐藥之用。

5 不足與展望

本實驗在沒有對照品的情況下，通過UPLC/QTOF MS/MS技術對中藥復方進行了化學成分的分析和鑒定，說明該技術非常適合于中藥復方成分的定性分析。但是，也正是由于缺少對照品，部分同分異構體或者相似母核的化合物無法確定其具體結構，在今后的實驗中還要結合標準品對這些成分進行鑒別。

表1 穩心顆粒中推測化合物的質譜信息Tab.1 Basic information about presumed compounds in Wenxin Granules

續表1