全蝎中多糖提取分離及其藥理作用研究

宋興爽　李佳懌　王婭玲　鄒婧　陶然　張珊珊　王集會

摘????? 要：在已有的全蝎酶解產物研究基礎上，分離全蝎中的蛋白，提純多糖，并研究全蝎中除去蛋白與未除蛋白多糖的抗炎作用。方法：用胰蛋白酶制備全蝎酶解液，乙醇沉出粗多糖，制備低純多糖，Sevag法除去多糖中的蛋白質，測定全蝎中多糖的質量分數并進行抗炎研究。結論：未除蛋白組的多糖質量分數為42.12%，除去蛋白的多糖質量分數為87.27%，全蝎中多糖可抑制RAW264.7炎癥反應，多糖蛋白對細胞炎癥抑制作用不明顯，除去蛋白后全蝎多糖對IL-6炎癥因子的抑制效果不顯著，對TNF-α炎癥因子抑制效果顯著，隨藥液濃度不斷增大，抑制效果先上升后下降，當質量濃度為1.5 mg·mL^-1時，藥液中TNF-α炎癥因子質量濃度最低，說明該質量濃度下全蝎多糖的抗炎效果最為顯著，減少了炎癥因子的分泌，具有重要研究價值和市場前景。

關? 鍵? 詞：全蝎;多糖;除蛋白;抗炎

中圖分類號：TQ 028??????? 文獻標識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）06-1023-04

Extraction and Separation of Polysaccharides from Scorpio and Their Pharmacological Effects

SONG Xing-shuang， LI Jia-yi， WANG Ya-ling， ZOU Jing， TAO Ran， ZHANG Shan-shan， WANG Ji-hui

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： On the basis of existing research on scorpion enzymatic hydrolysate， protein in Scorpio was separated， polysaccharide was purified， and anti-inflammatory effects of protein removed and non-protein removed polysaccharide in Scorpio were studied. Methods： Scorpio enzymolysis liquid was prepared by trypsin， crude polysaccharide was precipitated by ethanol， low pure polysaccharide was prepared， protein in polysaccharide was removed by sevag method， content of polysaccharide in Scorpio was determined and anti-inflammatory study was carried out. Conclusion： The polysaccharide content of the non-deproteinized group is 42.12%， the polysaccharide content of deproteinized group is 87.27%， the polysaccharide in Scorpio can inhibit RAW264.7 inflammatory reaction， the inhibitory effect of polysaccharide protein on cellular inflammation is not obvious， the inhibitory effect of Scorpio polysaccharide on IL-6 inflammatory factor after deproteinization is not significant， the inhibitory effect on TNF-α inflammatory factor is significant， with the increasing concentration of liquid medicine， the inhibitory effect first rises and then falls. When the concentration is 1.5 mg mL-1， the concentration of TNF-α inflammatory factor in the liquid medicine is the lowest， which indicates that Scorpio polysaccharide has the most significant anti-inflammatory effect at this concentration， reduces the secretion of inflammatory factor， and has important research value and market prospect.

Key words： Whole scorpion; glycoamine polysaccharides; deproteination; Anti-inflammatory

中藥全蝎始載于《蜀本草》，味辛，性平，有毒，為祛風攻毒常用藥，可用于治療痙攣抽搐、風濕、癲癇等疾病^[1]，具有很好的治療效果。多糖主要存在于動物類藥物中，由氨基糖和糖醛酸組成^[2]，在免疫調節、腫瘤治療、炎癥反應等方面具有一定的治療作用^[3]。

在生物體中，多糖與蛋白質的結合狀態易被水解破壞，因此本實驗采用sevag法和水提醇沉法除去糖蛋白中的蛋白質，測定全蝎中多糖的含量并進行體外抗炎實驗。

在進行Sevag法、水提醇沉法之前都將對藥物進行酶解。Sevag法對有機試劑用量大，但其適用范圍廣，可用于多種多糖提取時的蛋白分離。

1 ?材料

1.1? 樣品

全蝎凍干粉（實驗室自制）。

1.2? 試劑

胰蛋白酶、氯仿、苯酚、無水乙醇等所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水，細胞炎癥試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3? 儀器

HH-6 數顯恒溫水浴鍋;KQ-500E 型超聲波清洗器;SHB-III循環水式真空泵;ST 16R 高速冷凍離心機;FA 1004N 電子天平;UV9100B型紫外可見分光光度計。

2? 步驟

2.1? 全蝎多糖標準曲線

稱取0.1 g恒重無水葡萄糖，溶解定容為

1 mg·mL^-1，配制不同質量濃度溶液，各加入1 mL 5%的苯酚^[4]，混勻，加入5 mL濃硫酸^[5]，搖勻過程中小心濺出燙傷，放入90 ℃的水浴鍋中靜置20 min，放冷，測定待測溶液中490 nm波長下^[6]多糖的吸光度。

2.2? 制備全蝎酶解液

通過前期查閱文獻已經確定制備全蝎酶解液的最佳工藝流程：料液比為1∶40 g·mL^-1[7]，酶解溫度40 ℃，酶解時間3 h，最適pH=8.5，胰蛋白酶為??? 2 000 u，離心抽濾，冷藏保存。

2.3? 醇沉提取多糖蛋白

在酶解液中加入無水乙醇調至溶液的質量分數為80%^[8]，以3 000 r·min^-1離心10 min，可分離出多糖蛋白，取上清液重復上述步驟，直至沒有沉淀析出為止^[9]，分離沉淀，凍干，得到全蝎多糖蛋白。

2.4? Sevag法除蛋白提取多糖

料液比1∶40 g·mL^-1，40 ℃下進行超聲20 min，加入胰蛋白酶酶解。調pH為7.5，40 ℃下恒溫酶解3 h，酶解后置于100 ℃水浴鍋內10 min煮沸滅酶，離心去除雜質。移液槍移取40 mL氯仿加入10 mL正丁醇中制得 Sevag試劑^[10]。取5 mL粗提液置于試管中，加入1 mL Sevag試劑，振搖30 min，靜置12 h后離心，旋蒸濃縮，加入適量80%無水乙醇，沉淀12 h，離心10 min，將沉淀分離凍干，計算全蝎中除去蛋白后多糖得率。

2.5? 抗炎實驗

2.5.1 ?細胞培養

取出冰凍保存的RAW264.7細胞，加入DMEM高糖培養基，細胞長滿板底后進行消化換液，收集細胞懸液，放入5% CO₂培養箱中37 ℃恒溫培養^[11]，放入離心機中以1 000 r·min^-1離心3 min后，傾出上清液，重復上述步驟，進行傳代培養^[12]。

2.5.2 ?細胞因子含量測定

將細胞放入培養箱中培養，細胞長滿后，吸出培養液，加入2 μg·mL^-1 LPS 500 μL，用移液槍分別取500 μL的質量濃度為4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mg·mL^-1的全蝎多糖蛋白液與全蝎多糖液，每組設置一個LPS組與空白組，24 h后，收集上清液^[13]，進行炎癥因子TNF-α和IL-6的質量濃度測定^[14]。

2.5.3 ?數據分析

采用spss軟件對結果進行分析。

3? 結果

3.1? 多糖標曲

如圖1所示，標準曲線方程為y = 2.045x- 0.004 8，R²=0.999 6，結果表明多糖質量濃度不同會引起吸光度不同。

3.2? 除蛋白前后多糖質量分數測定

如表1所示，將吸光度值代入線性方程中計算醇沉全蝎酶解液提取蛋白多糖所得糖蛋白質量分數分別為42.56、41.17、42.64 mg·g^-1，平均得率為42.12%。

如表2所示，全蝎中的蛋白質除去后所測多糖含量為87.43、87.02、87.36 mg·g^-1，平均得率為87.27%，相比于未除蛋白以多糖蛋白形式存在時得率差異較大，全蝎提取多糖得率明顯提高。

3.3? 體外抗炎實驗

體外抗炎實驗中，組別編號1-7分別對應正常細胞組，炎癥誘導組及質量濃度為2.00、1.50、1.11、0.50及0.25 mg·mL^-1全蝎多糖蛋白，結果表明，全蝎多糖蛋白5組不同濃度的劑量組的細胞IL-6、TNF-α炎癥因子水平均高于正常細胞組和炎癥誘導組^[15]，見表3，就整體而言沒有明顯作用趨勢，如圖2所示，經多次重復實驗，排除實驗誤差的影響，多糖蛋白對細胞炎癥有抑制作用不明顯，可能原因為蛋白質與多糖結合阻礙了全蝎多糖中有效成分發揮作用，不僅未起到抑制作用反而會誘導炎癥作用。

如圖3、表4所示，全蝎中除去蛋白質后多糖的抗炎效果顯著高于未除蛋白之前。與未除蛋白質之前相同，全蝎多糖除蛋白后5組不同質量濃度的劑量組的IL-6炎癥因子水平均高于正常細胞組和炎癥誘導組。全蝎多糖對IL-6炎癥因子的抑制效果不顯著，對TNF-α炎癥因子抑制效果顯著，隨藥液質量濃度不斷增大，抑制效果先上升后下降^[16]，當質量濃度為1.5 mg·mL^-1時，藥液中TNF-α炎癥因子質量濃度最低，隨著質量濃度的降低，炎癥發生反而增強，說明該濃度下全蝎多糖的抗炎效果最為顯著，臨床效果最佳。

4? 結束語

細胞炎癥為人體常見疾病之一[17]，并能間接引發腫瘤等疾病。小鼠白細胞介素IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥因子則為直接誘導因素[18]，導致人體調節紊亂、白細胞增多、局部組織病變等[19]。一般情況下出現炎癥多為人體的自我防御機制，通過炎癥反應進而引起人們警惕。炎癥反應可由腫瘤壞死因子、內毒素等影響因子引起，許多中藥在治療臨床炎癥不良反應方面可發揮重要作用。

全蝎具有軟堅散結、搜風通絡、祛風逐瘀的療效，常與蜈蚣結合成藥對使用[20]，周青[21]等通過藥理實驗證明從全蝎蝎尾中提取的蝎毒對于肺癌、胃癌、前列腺腫瘤具有一定的抑制作用;代龍[22]通過制備全蝎酶解液發現全蝎具有較好的抗凝血作用;梁益[23]等以海馬作為慢性癲癇模型證明乙醇提取全蝎中的有效物質可有效減少癲癇的發生，降低患病風險。

目前關于全蝎的研究較多，但將全蝎中多糖蛋白分離測定除蛋白后的多糖含量較少[24]，本實驗采用胰蛋白酶制備全蝎酶解液，乙醇沉出粗多糖，制備低純多糖，Sevag法除去多糖中的蛋白質，測定全蝎中多糖的質量濃度并進行抗炎研究。體外抗炎實驗表明，若未除蛋白，全蝎多糖蛋白抑制效果整體作用趨勢不明顯;除去蛋白后，全蝎多糖對IL-6炎癥因子的抑制效果不顯著，對TNF-α炎癥因子抑制效果顯著，隨藥液質量濃度不斷增大，抑制效果先上升后下降，當質量濃度為1.5 mg·mL-1時，藥液中TNF-α炎癥因子質量濃度最低，說明該質量濃度下全蝎多糖的抗炎效果最為顯著，炎癥因子最少，結果表明全蝎具有一定的抗炎作用，可用于新藥物研發。

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