膠體金試紙條快速檢測動物源性食品中頭孢氨芐殘留

劉敏軒，趙興然，于璐，鹿浩志，王向紅

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

頭孢菌素類抗生素是7-氨基頭孢烷酸（7-aminocephalosporanic acid，7-ACA）的衍生物[1-2]，多為有機酸性物質，頭孢菌素類抗生素的殺菌作用較強，常被用來預防和治療動物性疾病，并存在多種抗生素聯用的現象，因而在動物源性食品中可能存在抗生素殘留問題[3]。由于動物源性食品營養價值高，動物產品消費量巨大，動物源性食品中抗生素殘留問題也日益受到人們的廣泛關注[4-5]。頭孢菌素類抗生素的濫用會造成其在畜產品中的殘留，人類食用后會對人體產生過敏反應、胃腸道菌群失衡和細菌耐藥性增強等不良影響[6-7]。因此，建立一種高效、便捷、快速的頭孢菌素類抗生素多殘留測定方法極為迫切。

目前，頭孢菌素類抗生素殘留的檢測方法主要有微生物分析法、免疫分析法（immunoassay，IAS）、液相色譜法（liquid chromatography，LC）、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）和電化學分析法等。微生物法[8]檢測的時間較長、靈敏度低、操作人員要求高；高效液相色譜法（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）[9-13]等儀器檢測法程序復雜、成本較高，不利于現場大批量樣品的測定；電化學分析法由于其穩定性欠佳，還沒有普遍推廣使用[14]。眾多檢測方法中，膠體金免疫層析技術[15-16]憑借其操作簡單易行、分析時間短、檢測效率高、結果可靠準確、適合樣品大批量現場快速篩檢等優勢被廣泛用于食品安全檢測，應用前景廣闊。

為了建立一種用于頭孢菌素類抗生素殘留測定的快速檢測方法，本研究采用膠體金作為信號探針，基于免疫競爭原理，以硝酸纖維素膜（NC膜）為反應載體，以頭孢氨芐（cefalexin，CEX）包被原（CEX-OVA）為檢測線（T線），羊抗兔二抗為質控線（C線）開發了檢測頭孢菌素類抗生素的膠體金免疫層析試紙條，并成功通過樣品的添加回收試驗，驗證了其實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

頭孢氨芐抗血清：河北農業大學食品科技學院食品分析與營養實驗室，采用謝會玲等[17]的方法制得；頭孢氨芐（cefalexin，CEX）、頭孢拉定（cefradine，RAD）、頭孢羥氨芐（cefadroxil，CFR）、頭孢哌酮（cefoperazone，CFP）、頭孢唑啉鈉（cefamezin，CZN）、頭孢唑啉（cefazolin，CFZ）、頭孢噻肟（cefotaxime sodium，CTX）、頭孢呋辛（cefuroxim，CXM）：上海源葉科技有限公司（上海）；氯金酸、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）：Sigma公司（美國）；N，N’-二環己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）：阿拉丁化學有限公司（上海）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）、硼酸緩沖液、羊抗兔IgG：北京索萊寶有限公司（北京）；NC膜：Millipore公司（美國）；樣品墊、結合墊、吸水紙以及PVC底板：上海金標科技有限公司（上海）；待測樣品：保定人人超市（保定）；其他化學試劑均為分析純。

恒溫磁力攪拌器（JB-2型）：上海一恒電子科技有限公司（上海）；恒溫培養箱（DH5000Ⅱ）：上海精密試驗設備有限公司（上海）；冷凍離心機（TDL-5）：上海Anke（上海）；半自動劃膜儀XYZ3010：上海捷寧生物（上海）。

1.2 方法

1.2.1 CEX包被原的制備

合成步驟采用Matsuura等[18]的方法。稱取20.00 mg CEX、13.25 mg NHS、26.11 mg DCC 溶于 1.40 mL DMF中，經渦旋混勻，于室溫25℃孵育3h。取900μL反應液慢慢滴加到3 mL NaHCO3溶液中（濃度為0.10 mol/L，含有20.20 mg OVA），低溫振蕩反應2 h以上，置于4℃冰箱中反應過夜，得到包被原CEX-OVA。用紫外分光光度計法對偶聯物CEX-OVA進行表征，在200 nm～500 nm的波長范圍內對其進行掃描，通過組分特征峰推斷偶聯物是否制備成功。

1.2.2 膠體金的制備與表征

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[19]。將1gHAuCl4配成1%的水溶液，于4℃避光存放，使用時再配制成0.01%的溶液。在磁力攪拌下，將0.01%HAuCl4水溶液加熱至沸騰并保持3 min，迅速加入檸檬酸三鈉溶液，待其變為透明的紅色且保持不變時，煮沸5 min，撤去熱源，攪拌15 min。自然冷卻至室溫25℃，加雙蒸水至原體積，通過紫外掃描和透射電鏡法對制備的膠體金進行表征。

1.2.3 金標抗體的制備

將純化后的抗體蛋白用硼酸緩沖液進行稀釋，磁力攪拌下，逐滴加入到10 mL膠體金溶液（pH=9.0）中，繼續攪拌10 min，加入10%BSA至其終濃度為1%，繼續攪拌30 min后4℃靜置過夜。取出溶液于4℃低速離心除去沉淀，上清液于10 000 r/min低溫離心30 min。去上清，用儲存液將暗紅色沉淀重懸，重復離心1次，重懸至1 mL，4℃放置。

1.2.4 標記CEX抗體蛋白條件的優化

將 100 μL 不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0）的膠體金溶液置于酶標板中，每孔加入3 μg CEX抗體，混勻后于室溫25℃放置15 min，每孔添加20 μL 10%NaCl溶液，混勻后于525 nm波長下測定OD值。

分別向1 mL的膠體金溶液中加入不同濃度的抗體（0.0、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、12.0、24.0、48.0 μg/mL），混勻后加入100 μL 10%NaCl溶液，反應1 h后于525 nm波長下測定OD值。

1.2.5 試紙條檢測條件的優化

將二抗點樣于NC膜上，分別用不同的封閉液（1%BSA、1%明膠、1%酪蛋白、5%脫脂乳和5%甘氨酸）在37℃條件下封閉30 min，取出后用PBST沖洗3次，干燥，滴加金標抗體進行顯色，選擇顯色條帶清晰且無背景色的封閉液。分別采用0.5、1.0、1.5 μg的CEXOVA為包被區，將金標抗體分別按1∶1、1∶5和1∶10體積比稀釋后，取100 μL滴加到包被區，選擇顯色效果較好的濃度和稀釋比例應用于試驗。

1.2.6 樣品前處理及添加回收驗證

牛奶樣品取全奶6 mL于離心管，4℃，9 000 r/min離心15 min，棄掉上層脂肪，取下層；牛肉、豬肉、蝦肉樣品，稱取均質試樣（1.0±0.001）g，按 1 ∶1（質量體積比）加入乙腈水溶液（8∶2，體積比），漩渦振蕩，超聲提取15 min，于室溫（20℃～25℃）、3 500 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm有機濾膜備用。生豬肝、熟豬肝樣品使用1∶3（質量體積比）乙腈水溶液（8∶2，體積比），4 000 r/min離心，取上清液過0.45 μm有機濾膜備用。向樣品中添加一定濃度的標準品溶液進行添加回收試驗。本試驗通過HPLC方法對試紙條的準確性進行驗證。

2 結果與討論

2.1 紫外分光光度計法鑒定CEX-OVA的合成

抗原和膠體金的表征見圖1。

圖1 抗原和膠體金的表征Fig.1 Characterization of antigen and colloidal gold

圖1a為CEX、OVA和CEX-OVA的紫外掃描圖，可知CEX與載體OVA偶聯后，其偶聯產物CEX-OVA的吸收圖譜分別具有CEX與OVA的特征吸收峰，O VA偶聯CEX后蛋白質的特征峰形狀和位置發生了變化，表現為各自迭加的性質，初步說明OVA分子上已經成功偶聯CEX。

2.2 膠體金紫外掃描法和透射電鏡法的鑒定結果

從光譜圖1b可知，制得的膠體金溶液在525 nm處有最大吸收峰，由最大吸收波長λmax與膠體金顆粒的線性回歸方程 Y（λmax）=0.427 1X（顆粒直徑）+514.56[20]，可初步估算出金顆粒的直徑約為24.4 nm，吸收峰峰寬為 149 nm。由式 Y（CV）=0.360 5X（峰寬）-53.549可得，直徑變異系數CV為16.6%，表明溶液中金顆粒的粒徑分布較均勻。

膠體金的透射電鏡圖1c、圖1d所示，膠體金顆粒的大小基本一致，分散較均勻，沒有多角形的顆粒存在，直徑約為24 nm，與紫外掃描結果基本一致。

2.3 膠體金標記CEX抗體條件的確定

膠體金標記CEX抗體條件的確定試驗參數優化結果見圖2。

圖2 試驗參數優化結果Fig.2 Optimization of the experimental parameters

圖2a為不同pH值條件下金標抗體OD值的變化，隨著體系pH值的升高，金標抗體的OD值不斷升高，當pH值達到9.0時，金標抗體的OD值達到最高，然后趨于穩定并逐漸減小，說明當體系pH值達到9.0時，金納米顆粒與抗體二者結合最為穩定。故標記抗體蛋白的溶液pH值選9.0。由圖2b可知，當抗體蛋白用量小于9 μg時，吸光值隨著抗體蛋白用量的增加而增大，當抗體蛋白用量大于9 μg時，吸光度值趨于平衡。表明抗體蛋白用量為9 μg時與膠體金結合最佳。

2.4 封閉液的優化

為了降低NC膜的非特異性吸附，需要用封閉液對膜上未結合的位點進行封閉，結果如表1。

表1 試紙條的封閉結果Table 1 The blocking results of the strips

未進行封閉處理、經5%甘氨酸、經1%BSA封閉處理的NC膜背景色較深，降低了檢測線與背景的反差，影響結果的判斷；經1%酪蛋白封閉處理的NC膜背景色較淺，條帶顯色較清晰；而經1%明膠和5%脫脂乳封閉處理的NC膜背景色較淺，條帶顏色鮮明，容易判斷結果。經5%脫脂乳封閉的NC膜條帶顯色最鮮明，封閉效果最為理想，且脫脂乳廉價易得。因此本試驗試紙條封閉液采用5%的脫脂乳。

2.5 CEX-OVA包被量和金標抗體稀釋度的確定

CEX-OVA包被量和金標抗體稀釋度與試紙條的顯色結果直接相關，結果如表2。

表2 金標抗體稀釋度和包被原CEX-OVA包被量的優化Table 2 Optimization of the dilution fold of the gold-labeled antibodies and coated antigen CEX-OVA

當包被0.5 μg的CEX-OVA時，T線處結合的金標抗體比較少，顯色較淺；包被量為1.5 μg時，T線的顯色偏深，1.0 μg與1.5 μg的顯色效果基本相同。當金標抗體的稀釋度在1∶5時，3個包被量的試紙條顯色情況均較好。因此選擇包被1.0 μg的包被原，金標抗體的稀釋度為1∶5。

2.6 二抗稀釋倍數的優化

將二抗進行稀釋作為C線，取金標抗體稀釋液100 μL滴加到包被區顯色，優化結果見圖3。

圖3 酶標二抗的稀釋倍數的優化結果Fig.3 Result of HRP antibody conjugates for different dilution fold

由圖3可知，隨著二抗稀釋倍數的加大，C線的顯色越來越淺。當稀釋倍數為20時，NC膜上C線的顯色較T線深，不利于測定結果的判斷；稀釋倍數為40時，C線的顯色與T線相當，易于進行結果的判斷；當稀釋倍數為80、160、320時，NC膜上C線的顯色明顯淺于T線，基本不可見，影響試紙條的有效性。所以，二抗的最佳稀釋倍數為40倍。

2.7 CEX檢出限的確定

將制備的膠體金試紙條對CEX的檢測限進行測定，結果如圖4所示。

圖4 CEX膠體金試紙條檢出限的確定Fig.4 The detection limit of colloidal gold strips for CEX

隨著CEX濃度的依次增大，T線的顏色越來越淺，當CEX的濃度小于20 μg/L時，T線顏色明顯肉眼可見，與空白溶液不能由目測法進行區分；當其濃度等于或大于20 μg/L，T帶顯色較淺甚至消失，能通過目測將兩者分開，因此該試紙條對于CEX的檢出限為20 μg/L。

2.8 膠體金試紙條特異性的檢測

在最優檢測條件下，所制試紙條對頭孢菌素類抗生素的檢測靈敏度差異較大，用同樣的方法檢測其他7種頭孢類抗生素，結果如圖5所示。

圖5 其他7種頭孢菌素類抗生素的試紙條檢測結果Fig.5 Test strip test results of 7 other cephalosporin antibiotics

該試紙條對CFP、CZN、CFZ、CTX和CXM的特異性不明顯，對這幾種頭孢菌素類抗生素無交叉反應，但對CEX、RAD、CFR的靈敏度較高，即交叉反應率高，可進一步研究多殘留檢測。由顯色結果可判斷7種抗生素的檢測限，如表3所示。

表3 CEX和其他7種頭孢菌素類抗生素的檢測限Table 3 Detection limits for CEX and seven other cephalosporin antibiotics

2.9 待測物的添加回收試驗和HPLC方法驗證

蝦肉提取液進行20倍稀釋，牛奶、牛肉、豬肉提取液進行40倍稀釋，生豬肝、熟豬肝提取液進行80倍稀釋后，用試紙條檢測，條帶顯色清晰且無背景色，顯色效果與對照接近，即基質影響基本消除。6種樣品的加標提取液經過基質消除后，用試紙條測定，低檢出限為 20 μg/L，結果如表 4。

表4 6種樣品的CEX添加回收檢測結果Table 4 The determination results of CEX in six samples

用HPLC法與試紙條（n=3）進行測定，結果如表5所示。

表5 樣品中不同CEX添加水平的HPLC與試紙條測定結果比較Table 5 CEX of results obtained by HPLC and strips at three spiked level

續表5 樣品中不同CEX添加水平的HPLC與試紙條測定結果比較Continue table 5 CEX of results obtained by HPLC and strips at three spiked level

所建立試紙條法與HPLC法在檢測范圍內有很好的相關性，即試紙條法準確可靠，可用于實際樣品的測定。

3 討論

本文建立了快速檢測動物源性食品中CEX殘留量的膠體金標記免疫分析方法。通過對試紙條檢測條件優化，對CEX檢測限為20 μg/L，經過樣品提取液校正后其檢測限為20 μg/L，整個檢測過程僅需10 min，實現了對CEX的快速檢測。用HPLC法對試紙條的可靠性進行評估，結果表明兩者一致性較好，即試紙條法的測定結果準確可靠。適用于實際動物源性食品中頭孢菌素類抗生素樣品的現場快速篩查。成功建立可檢測頭孢類抗生素殘留膠體金免疫層析試紙條。