SPME/SDE-GC-MS分析寧德養殖大黃魚揮發性化合物

魏育坤，魏好程，伍菱，2，3，楊燊，4，邱緒建，4，黃志勇，倪輝，2，3，*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建廈門361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門361021；4.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建廈門361021）

大黃魚（Larimichthyscrocea），鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaeni-dae），黃魚屬，別名黃魚、大黃花魚、黃瓜魚等，是傳統“四大海產”之一，我國近海主要經濟魚類[1]。大黃魚是我國養殖規模最大的海水魚，養殖主要集中在福建寧德，2018年大黃魚產量高達14萬噸，占全國總產量的70%，總產值超百億元。大黃魚肉嫩味美、富含蛋白質、微量元素和維生素，對體質虛弱的人具有很好的食療效果，由于具有令人愉快的風味，深受消費者的喜愛[2]。除食用新鮮的大黃魚外，大黃魚已被加工成黃魚鲞、酒糟黃魚等加工產品。相關研究表明，魚肉中的揮發性化合物復雜，種類繁多，不僅對魚肉風味起著重要的影響[3]，而且是反映魚新鮮程度[4]及進行品質溯源的重要指標[5]；因此，對大黃魚的揮發性成分進行檢測、監控具有重要的意義。

目前，萃取魚類揮發性物質的手段主要包括：同時蒸餾萃取（simultaneous distillation-extraction，SDE）[6]、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）[6]、超臨界流體萃取 （supercritical fluid extraction，SFE）[7]和溶劑輔助風味蒸發萃取（solvent assisted flavour evaporation，SAFE）[8]等。其中，SPME技術是具有無溶劑性、操作簡便、高效和靈敏度高等特點[9]，是目前最常用手段之一；但是SPME技術偏向于提取低沸點的揮發性化合物，對高沸點物質的提取效率低。SDE技術融合了水蒸氣蒸餾和有機溶劑萃取兩種技術，提取的物質側重于對中、高沸點的化合物[10]，這一優點彌補SPME技術上的缺點。因此，國內外學者常采用SPME和SDE相結合的方法提取樣品中的揮發性化合物。Chang等[6]利用SDE和SPME兩種方法提取鱈魚中揮發性化合物，發現SDE提取得到24種揮發性成分，SPME提取得到69種揮發性成分，其中SDE和SPME提取成分中有10種相同成分。徐永霞等[11]采用SPME結合SDE法從豬肉湯中提取出77種揮發性風味成分，其中SPME檢測出醛類物質較多，SDE檢測到醇類和酯類較多。上述研究表明，SPME法和SDE法對不同種類化合物的萃取能力存在差異，兩種方法結合分析同一樣品揮發性化合物，可以更加全面的反映樣品的風味成分。研究學者通常采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-質譜/嗅聞[12]（gas chromatography-mass spectrometry/olfactometry，GC-MS/O）、氣相色譜-火焰離子化檢測器[13]（gas chromatography-flame ionization detector，GCFID）、飛行時間質譜聯用[14]（time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS）等技術分析食品中揮發性化合物。其中，氣相色譜-質譜聯用技術操作簡單且分離效果好，被廣泛的用于檢測食品中復雜揮發性化合物。

近幾年，已有研究學者研究大黃魚的揮發性化合物。楊茗媛等[15]利用電子鼻和SPME-GC-MS對大黃魚的揮發性成分進行了分析，表明新鮮大黃魚的腥味物質主要是己醛、庚醛和辛醛，并且伴隨著對大黃魚加熱溫度的升高，腥味物質呈現減少趨勢。徐軍方等[16]利用電子鼻和SPME-GC-MS對比不同冷藏條件下大黃魚風味的變化，發現低溫凍藏可以有效保留大黃魚的風味。Mu等[17]利用SPME-GC-MS分析野生大黃魚與養殖大黃魚揮發性化合物的差異，研究發現與野生大黃魚相比，養殖大黃魚醛類和烴類物質的含量高，酯類物質含量較低；同時發現，區別野生大黃魚與浙江寧波養殖大黃魚的主要成分是辛醛和1-辛烯-3-醇，但大黃魚的揮發性成分尚未得到充分鑒定。

本研究以我國大黃魚主產區--福建寧德市養殖的凍鮮大黃魚為研究對象，采用的SPME和SDE兩種方法對大黃魚中揮發性化合物萃取，并結合GC-MS和相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）進行分析研究，鑒定大黃魚的主要揮發性成分，尤其是香氣貢獻成分，為全面了解大黃魚風味品質及建立溯源技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍鮮大黃魚：寧德市橫嶼島水產有限公司，經宰殺、去內臟，其個體長約30 cm、重500 g左右。

環己酮、正構烷烴（C8-C40）、乙醇、正己烷（色譜級）：Sigma公司。

1.2 儀器與設備

QP-2010 Plus氣相色譜質譜串聯儀、Rtx-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 色譜柱、65 μm CAR/PDMS萃取頭：日本島津公司；57330-U手動SPME進樣器：美國Supelco公司；Likens-Nickerson同時蒸餾萃取裝置：鄭州鑫瑞化驗廠；HH-1數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；XB-CPJ高速多功能粉碎機：永康市久品工貿有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大黃魚樣品前處理

凍鮮大黃魚在流水的條件下解凍約2 h，去掉魚頭、魚鰭、魚鱗、黑皮和主骨，用絞肉機搗碎魚肉，并分裝，置于-18℃的環境下保藏，備用。

1.3.2 SPME提取大黃魚揮發性化合物方法

SPME法提取揮發性化合物方法參照相關的文獻[18]，準確稱取10 g凍鮮大黃魚置于50 mL的頂空瓶，加入10 mL的蒸餾水和10 μL濃度為1 mg/mL的內標物環己酮，密封頂空瓶，置于70℃的水浴鍋中平衡30 min。將經250℃老化后的萃取頭通過瓶蓋插入頂空瓶中，萃取頭暴露在頂空瓶的頂空位置，吸附30 min。吸附結束后，迅速將萃取頭插入GC-MS進樣口，解吸3 min，由GC-MS進行后續的分析鑒定。

1.3.3 SDE提取大黃魚揮發性化合物方法

SDE法提取揮發性化合物方法參考文獻[19]，準確稱取50 g經攪碎的凍鮮大黃魚肉樣和200 mL的蒸餾水于1 000 mL的圓底燒瓶，量取100 mL正己烷于500 mL的平底燒瓶，將兩個燒瓶分別連接在同時蒸餾萃取裝置的兩端，并采用電熱套進行加熱。通過控制兩邊電壓，達到同時沸騰的狀態，整個萃取的過程時長80 min。收集萃取液，添加過量的無水硫酸鈉，去除萃取液中多余的水分，靜置過夜，經旋轉蒸發儀濃縮至1 mL，密封，置于-18℃的環境下保存。GC-MS分析前，取100 μL樣品，用正己烷稀釋4倍，加入1 μL濃度為1 mg/mL的內標物環己酮，進樣量1 μL進行GCMS分析。

進行數字線劃圖工作的開展時，一般采用全數字攝影測量工作站的方式完成測量任務，同時運用有關圖像編輯軟件予以編輯處理，確保具體的格式為DWG。此過程中應做到下述幾點：其一，開展地形圖測繪時，應建立與數字匹配的地面模型，并明確具體方向。而此環節中出的差異，由于運用了自動交互操控的方式，因此需以具體操控步驟予以科學安排測量工作內容，讓誤差處于可控狀態下；第二，測繪地形圖以前，應保證定位的科學性，讓各個因素均存在相應準確的線型、顏色和標準的代碼；第三，采用加大地形圖測繪人員培訓力度的方式，提升其專業能力，讓所采集的地物和地貌信息誤差率得以下降，達到最小的目的。

1.3.4 GC-MS分析大黃魚揮發性化合物條件

色譜條件：氣相色譜柱為Rtx-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣為高純氦氣（純度99.999%），柱流量3 mL/min，不分流進樣。

升溫程序：進樣口溫度為220℃，初始溫度50℃保持5 min，以6℃/min的速度升溫至250℃保持5 min。

質譜條件：離子源溫度230℃，電離方式EI，電離能量70 eV，接口溫度250℃，掃描方式設為SCAN模式進行定性分析，離子碎片的掃描范圍m/z 35～450。溶劑延遲時間2.5 min。定量分析時質譜掃描方式設為SIM模式。

1.4 揮發性化合物的定性分析

對比質譜數據庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）進行相似度檢索，根據不同化合物的基峰、質荷比進行串聯檢索與人工解析，化合物鑒定標準為其質譜匹配度大于80%。計算待測化合物的保留指數并與文獻中報道的保留指數對比定性。保留指數的計算參照Kratz和Vandendool[20]的方法：

式中：RIX為目標化合物的保留指數；RTx為目標化合物的保留時間，min；RTn+1、RTn為目標化合物出峰前后相鄰兩個正構烷烴的出峰時間，min。

1.5 揮發性化合物的定量分析

定量分析采用內標法進行定量，根據環己酮的濃度估算待測物的含量，計算公式為：

1.6 相對氣味活度值法（ROAV）確定大黃魚關鍵香氣成分

參照劉登勇等[21]的方法，大黃魚關鍵香氣成分采用ROAV值進行評價，定義對香氣貢獻最大的組分為ROAVs=100，其他揮發性化合物的ROAV值計算公式如下：

各揮發性化合物的ROAV≤100，本研究認為ROAV≥1的揮發性化合物是大黃魚的關鍵香氣成分，0.1≤ROAV＜1的揮發性化合物對大黃魚整體的風味有修飾作用[22]。

1.7 統計分析

通過Microsoft Office Excel 2010軟件計算試驗數據的平均值和標準偏差，并繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 SPME和SDE提取大黃魚中揮發性化合物定性分析

采用SPME和SDE兩種方法提取大黃魚中的揮發性化合物，結合GC-MS分析，得到的總離子流圖如圖1所示。

圖1 大黃魚SPME和SDE提取物中揮發性化合物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds of SPME and SDE extracts from large yellow croaker

從圖1發現，SPME出峰靠前且較集中，而SDE出峰分布廣泛且后期出峰多，說明SPME法適用于提取低沸點的揮發性化合物，SDE法適合提取中、高沸點的揮發性化合物。這個現象與Li等[23]采用SPME和SDE對草魚湯揮發性化合物的出峰情況相似。

根據相似度檢索、特征離子碎片分析以及參照相關文獻，鑒定結果如表1所示。

由表1可知，SPME提取到29種揮發性化合物，包括醛類12種、醇類3種、酮類3種、芳香烴化合物4種、烴類5種和酯類2種；SDE提取到26種揮發性化合物，包括醛類6種、醇類2種、酮類5種、烴類2種、酯類4種和其他類7種；兩種方法共同提取到6種揮發性化合物，分別為壬醛、癸醛、反，反-2，4-癸二烯醛、2-十一碳烯醛、2，6，10，14-四甲基-十五烷、十六烷酸乙基酯。SPME-GC-MS前期檢測到己醛、反，反-2，4-庚二烯醛、辛醛和反-2-辛烯醛沸點很低，但是SDE-GC-MS中未檢測到；SDE-GC-MS后期檢測到2，4-二-叔丁基苯酚、棕櫚酸、十六碳酰胺、油酸酰胺、硬脂酸酰胺和芥酸酰胺，其沸點普遍很高，在SPMEGC-MS中未檢測到，這可能是SDE萃取是在高溫下反復蒸煮進行的，對低沸點化合物萃取能力弱[24]。SPME和SDE兩種方法提取大黃魚揮發性化合物經GC-MS檢測，共鑒定出7大類49種揮發性化合物，相關學者[2]采用SPME提取養殖大黃魚揮發性化合物，檢測出39種揮發性化合物，說明兩種方法提取大黃魚揮發性化合物更全面。

表1 大黃魚SPME和SDE提取物中揮發性化合物鑒定結果Table 1 Identification of volatile compounds of SPME and SDE extracts from large yellow croaker

續表1 大黃魚SPME和SDE提取物中揮發性化合物鑒定結果Continue table 1 Identification of volatile compounds of SPME and SDE extracts from large yellow croaker

2.2 SPME和SDE提取大黃魚中揮發性化合物定量分析

根據內標法計算各揮發性化合物的濃度和相對含量，結果如表1所示，各類化合物的相對含量如圖2所示。

圖2 SPME和SDE提取大黃魚揮發性化合物的類別含量圖Fig.2 Classification of volatile compounds of SPME and SDE extractions from large yellow croaker

從圖2中發現，SPME和SDE兩種方法結合GC-MS檢測到同類揮發性化合物的相對含量具有明顯的差異，SPME-GC-MS檢測到相對含量最多的化合物是醛類（59.27%），其次是烴類（16.62%）、醇類（10.64%）、酮類（8.62%）、芳香烴（4.34%）和酯類（0.52%），SDE-GC-MS檢測到相對含量最多的化合物是酮類（33.55%），其次是醛類（26.38%）、烴類（9.14%）、酯類（5.64%）、醇類（5.47%）和其他類（19.81%）。此現象表明SPME對醛類、醇類、烴類和芳香烴化合物提取效果好，而SDE對酮類和酯類化合物提取效果好。因此，采用兩種方法結合分析，避免單一的提取手段對不同種類揮發性化合物的選擇性，對大黃魚中的各類揮發性化合物定量更充分。

從表1可知，SPME提取大黃魚含量最高的揮發性化合物是壬醛（1 376.84 ng/g），但經SDE提取到壬醛含量較低（89.74 ng/g），楊茗媛等[15]在研究浙江舟山市養殖大黃魚的背部揮發性化合物發現，壬醛的含量最高（1 452.10 ng/g），并且隨著溫度的升高，含量呈現下降的趨勢。SDE提取到含量最高的揮發性化合物是2-辛酮（583.16 ng/g），該物質在相關學者[18]采用 SPME提取大黃魚風味的研究中未被發現。SPME提取癸醛、反，反-2，4-癸二烯醛和十六烷酸乙基酯的濃度比SDE提取的濃度低，可能是萃取頭吸附面積有限引起的[25]。SPME提取2-十一碳烯醛的含量比SDE提取的含量高，從7.23 ng/g降至13.47 ng/g，在相關學者[16]對大黃魚的揮發性化合物研究中未被報道。

上述研究表明，SPME和SDE兩種方法對提取的揮發性化合物存在一定的選擇性，兩種方法結合GCMS分析大黃魚的揮發性化合物，可以更加全面的了解揮發性成分信息。

2.3 大黃魚的關鍵香氣成分分析

揮發性化合物對大黃魚的貢獻程度取決于它在樣品中的相對含量和感官閾值。根據相關文獻已報道的香味閾值，計算各揮發性化合物的ROAV值，結果如表2所示。

由表2可知，SPME提取大黃魚的揮發性化合物，得到9種關鍵的香氣成分以醛類、醇類和烴類為主，ROAV值由高到低依次為：辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、反，正-2，6-壬二烯醛、反-2-癸烯醛、癸醛和檸檬烯，對大黃魚風味有修飾作用的揮發性化合物是反-2-壬烯醛、己醛、十二醛和反，反-2，4-庚二烯醛。SDE提取大黃魚的揮發性化合物，得到3種關鍵的香氣成分，以醛類為主，分別是反，反-2，4-癸二烯醛、癸醛和壬醛，對大黃魚風味有修飾作用的揮發性化合物是2-己酮。

表2 SPME和SDE提取大黃魚揮發性化合物的相對氣味活度值Table 2 Relative odor activity value（ROAV）of volatile compounds of SPME and SDE extractions from large yellow croaker

醛類物質主要來源于脂肪組織發生氧化反應，且該類物質的閾值較低[26]，對魚體的風味影響頗大，被認為是魚肉的主要風味。辛醛[27]、壬醛[27]、反，反-2，4-癸二烯醛[28]是油酸氧化的產物和亞油酸經氧化成氫過氧化物裂解的產物，辛醛具有油脂味，壬醛具有油脂味、腥味，反，反-2，4-癸二烯醛具有油脂味；癸醛是氨基酸降解的產物[29]，具有甜香和花香；其它醛類的關鍵香氣成分是反-2-辛烯醛、反，正-2，6-壬二烯醛和反-2-癸烯醛，主要呈現油脂味和腥味。醇類物質是脂質氧化、氨基酸代謝的產物[30]，不飽和醇類物質閾值較低[31]，對大黃魚的風味有影響。SPME提取的不飽和醛類物質1-辛烯-3-醇[32]由亞油酸經氧化為氫過氧化物裂解的產物，且具有土腥味和蘑菇味，且該物質普遍存在于魚的揮發性化合物中。烴類物質可能是類胡蘿卜素的分解產物[33]，SPME提取的關鍵香氣成分檸檬烯呈現柑橘味。

3 結論

本研究采用SPME和SDE結合GC-MS分析大黃魚揮發性化合物，共檢測出49種揮發性化合物，其中SPME法29種，SDE法26種。兩種方法對不同種類揮發性化合物提取能力不同，SPME提取的揮發性化合物以醛類、醇類、烴類和芳香烴化合物為主，SDE提取的揮發性化合物以酮類和酯類化合物為主。SDE提取到2-十一碳烯醛和2-辛酮在相關研究中未被報道。經ROAV分析確定了9種關鍵香氣成分，對大黃魚風味貢獻較大的物質是辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛。通過兩種方法提取大黃魚揮發性化合物與單一的提取方法對比得知，兩種方法提取的揮發性化合物更全面、更準確，該結果為全面了解大黃魚風味品質及建立溯源技術奠定基礎，之后需要結合嗅聞技術及香氣重組進一步確定大黃魚的香氣構成。