高效液相色譜法檢測不同品種柑橘類果皮多甲氧基黃酮

劉洋，方迅，胡爽，凌敏，楊麗珠，徐蘭英

（黃岡師范學院化學化工學院，催化材料制備及應用湖北省重點實驗室，湖北黃岡438000）

柑橘果皮，為蕓香科柑桔屬植物橘（Citrus eticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，可經過除去雜質、噴淋水、潤透、切絲、干燥等一系列炮制過程得到傳統中藥陳皮，有理氣調中，燥濕化痰的功效[1]。柑橘果皮中含有多種化學活性成分，包括黃酮類化合物（flavonoids）、生物堿類（alkaloids）、揮發油類（vplatile oil）、檸檬苦素類（limonoids）、多糖類及微量元素[2-3]。其中多甲氧基黃酮（polymethoxy flavonoids，PMFs）為柑橘特有的化合物，現代藥理學研究表明其有廣泛的生物活性[4-6]，其中甜橙黃酮能顯著抑制癌細胞的增殖[7]。川陳皮素和陳皮素具有預防肥胖、輔助降血脂、抗炎的作用[8-12]。5-去甲基多甲氧基黃酮對人肺[13]、結腸[14-16]、乳腺[17]和白血病[18]癌細胞具有很強的抗增殖作用。5-去甲基川陳皮素和5-去甲基陳皮素是陳皮中最豐富的5-去甲基多甲氧基黃酮[19-21]。

隨著陳皮研究的不斷深入，研究者們發現，陳皮的藥效及重要生物活性大多與陳皮多甲氧基黃酮相關。陳皮是由新鮮柑橘果皮制備而得，柑橘果皮中多甲氧基黃酮的種類和含量受到多種環境條件及不同基因型的影響[22]。柑橘果皮選材不同，所制得陳皮中藥材中多甲氧基黃酮的種類和含量也會不同，進而影響到陳皮的藥效。因此，分析不同品種、不同產地柑橘果皮中多甲氧基黃酮的含量，對于陳皮的選材及其質量控制具有重要意義。目前，已有以紫外分光光度法和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定不同川陳皮中橙皮苷、川陳皮素的含量[23]，也有研究者采用HPLC法測定不同陳皮藥材中橙皮苷、川陳皮素和陳皮素等的含量[24]，以及用HPLC同時分析6種5-去甲基多甲氧基黃酮[25]。本文采用高效液相色譜法對6種主要多甲氧基黃酮（甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、陳皮素、5-去甲氧基川陳皮素、5-去甲基陳皮素）在9種不同品系、產地的柑橘中含量的差異進行了檢測和分析，以期為陳皮的原材料選擇、質量合理控制提供一定參考。6種PMFs的結構式見圖1。

圖1 6種PMFs的結構式Fig.1 Structures of six PMFs

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘新鮮果實：京東生鮮水果。

無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；多甲氧基黃酮（PMFs）、甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、陳皮素、5-去甲氧基川陳皮素、5-去甲基陳皮素標準品：催化材料制備及應用湖北省重點實驗室自制，純度均大于98%。

1.2 儀器與設備

GWX-9623MB型電熱鼓風干燥箱、DZF-6020真空干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SHZ-III循環水真空泵、RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；CCA-20型低溫冷卻水循環泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；BSA124S分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DS-5510DT型超聲波清洗器：上海生析超聲儀器有限公司；UPT-II-10T優普系列超純水器：成都超純科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本Shimudzu公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC條件

色譜柱：GL Sciences Intersil C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～55%乙腈；15 min～20 min，55%～70%乙腈；20 min～25 min，70%～80%乙腈；25 min～30 min，80%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：326 nm；進樣量：10 μL。

1.3.2 標準溶液的配制

分別精密稱取甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、橘皮素、5-去甲基川陳皮素、5-去甲基橘皮素標準品各5.0 mg，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，其質量濃度為0.5 mg/mL，將其作為標準儲備液保存于4℃冰箱中，備用。采用逐步稀釋法得到 0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL 一系列不同質量濃度的標準工作溶液，過0.22 μm濾膜后進樣。

1.3.3 柑橘類果皮中多甲氧基黃酮的提取及檢測

將市售重慶柑橘、安遠臍橙、浦江美人桔、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔、浦江丑橘、臺州蜜桔、廣西皇帝柑、贛南臍橙新鮮果實洗凈烘干，收集果皮，將果皮洗凈于70℃干燥，然后將其粉碎備用。稱取干燥柑橘果皮粉末各1.0 g，用50 mL無水乙醇索氏提取至提取液無色，將提取液減壓濃縮成稠膏狀，稱重。然后將所得稠膏用乙醇溶解，定容至100 mL得樣品溶液，4℃保存備用。

將樣品溶液取上層清液，過0.22 μm濾膜后直接注入進樣瓶，按1.3.1色譜條件進行HPLC分析，檢測柑橘果皮中多甲氧基黃酮包括甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、橘皮素、5-去甲基川陳皮素、5-去甲基橘皮素含量，計算含量時，每個樣品平行測定3次取平均值。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件統計分析數據，計算標準偏差并繪制標準曲線。工作曲線繪制時所有試驗數據均為重復3次的試驗結果。

2 結果與分析

2.1 6種多甲氧基黃酮標準品的色譜分離

將6種多甲氧基黃酮標準品混合液，在1.3.1色譜條件下進行分離，結果如圖2所示。

由圖2可見，在給定的色譜條件下，6種主要多甲氧基黃酮均具有較好的峰形和分離度。

圖2 多甲氧基黃酮高效液相色譜圖Fig.2 Chromatograph of the six PMFs

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的繪制

對不同質量濃度的多甲氧基黃酮標準溶液分別自動進樣10 μL，按1.3.1色譜條件測定，記錄峰面積。以各標準工作溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標，對應的峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，并進行回歸計算得6種多甲氧基黃酮回歸方程。將最小濃度的6種多甲氧基黃酮標準品溶液繼續進行稀釋，按照1.3.1的色譜條件進樣測定，計算信噪比。每種黃酮在信噪比（S/N）為3和10處對應的多甲氧基黃酮標準品濃度作為檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），結果如表1所示。

表1 方法學考察Table 1 Results of the method investigations

由表1可知，6種多甲氧基黃酮在2.5 μg/mL～500 μg/mL范圍內線性關系良好，線性相關系數R2≥0.999 5。

2.2.2 日內和日間精密度

分別取質量濃度為0.05 μg/mL的6種多甲氧基黃酮標準溶液進行色譜分析，平行測定6次，記錄6種多甲氧基黃酮的峰面積，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）得日內精密度；連續5 d對分別配制的6種多甲氧基黃酮標準溶液進行色譜分析，記錄6種多甲氧基黃酮的峰面積，計算相對標準偏差得日間精密度，結果如表2所示。

由表2可知，6種多甲氧基黃酮標準品的日內日間精密度均小于2.8%，說明儀器精密度良好，可以滿足試驗要求。

表2 日內日間精密度、穩定性和重復性Table 2 Results precision，stability and repeatability test

2.2.3 穩定性考察

分別配制6種多甲氧基黃酮標準品溶液，配制完成后分別放置 0、2、4、8、12、24 h 后進行液相色譜分析，測定其峰面積，計算RSD值，考察方法的穩定性，結果見表2。試驗表明，6種多甲氧基黃酮在24 h內穩定性良好，除3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮的 RSD 為 1.71%外，其它5種多甲氧基黃酮的RSD均小于0.7%。

2.2.4 重復性考察

按1.3.3方法平行制備6份樣品溶液，在1.3.1色譜條件下，同時測定6種多甲氧基黃酮含量并計算RSD值，考察方法的穩定性，計算得RSD值均在2%以內，結果見表2，表明該方法的重復性良好。

2.2.5 回收率試驗

分別稱取0.50 mg 6種多甲氧基黃酮標準品溶液加入1.0 g干燥柑橘果皮粉末，按照1.3.3中的方法進行索氏提取、濃縮及溶液配制。將樣品溶液取上層清液，過0.22 μm濾膜后直接注入進樣瓶，按1.3.1色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積并按外標法計算樣品加樣回收率，將加樣回收率測定過程重復5次并計算RSD，結果見表2。由表2可見，6種樣品回收率都在97%至105%之間，回收率RSD值均在2.5%以內。

2.2.6 柑橘果皮中6種多甲氧基黃酮含量檢測

采用建立的液相色譜法對10種不同品種柑橘果皮提取物中的6種多甲氧基黃酮進行了檢測，采用保留時間和紫外光譜對照法對6種多甲氧基黃酮進行歸屬確證。相同色譜條件下，重慶柑橘果皮的液相色譜圖見圖3。

由圖3可見，重慶柑橘果皮中川陳皮素和橘皮素含量均較高，但未檢出5-去甲氧基橘皮素。

圖3 重慶柑橘果皮提取物液相色譜圖Fig.3 Chromatograph of the Chongqing citrus peel extracts

其它品種柑橘類果皮樣品色譜圖未一一在文中列出。根據液相色譜峰面積，將各多甲氧基黃酮峰面積代入表1回歸方程，計算對不同品種中6種PMFs化合物的含量。結果如表3所示。

由表3可見，不同品種柑橘果皮中的多甲氧基黃酮含量有明顯的差異，在這9種柑橘果皮樣品中，重慶柑橘、浦江美人桔、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔、廣西皇帝柑中總黃酮含量均較高，其中廣西沙糖桔多甲基黃酮總含量高達11.59 mg/g，果皮中多甲基黃酮總含量最少的品種是臺州蜜桔（1.11 mg/g）；廣西沙糖桔和浦江美人桔中甜橙黃酮含量較高，分別達到0.94 mg/g和1.51 mg/g；重慶柑橘、浦江美人桔、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔、廣西皇帝柑中川陳皮素相對含量較高（含量范圍2.54 mg/g～6.85 mg/g），其中廣西沙糖桔果皮中川陳皮素含量達到6.85 mg/g；重慶柑橘、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔和廣西皇帝柑中橘皮素含量較高（含量范圍1.91 mg/g～3.38 mg/g），其中廣西沙糖桔果皮中橘皮素含量達到3.38 mg/g；重慶柑橘、浦江美人桔、廣東皇帝柑和廣西皇帝柑中5-去甲基川陳皮素含量較高（含量范圍 0.59 mg/g～0.80 mg/g）；另外，5-去甲基陳皮素在所檢測的所有品種柑橘果皮中含量均極低，大部分品種的柑橘果皮中都未檢出5-去甲基陳皮素。

表3 不同品種柑橘果皮中6種PMFs含量Table 3 Contents of six PMFs in different varieties of citrus peel

3 結論

本研究采用乙醇索氏提取結合高效液相色譜，建立了分離檢測6種主要多甲氧基黃酮含量的方法。該方法簡便、準確為柑橘果皮中多甲氧基黃酮的質量檢測及陳皮中藥材的制備及質量控制提供了參考方法和科學依據，同時也為其他天然產物同類化合物的研究提供了思路借鑒。