常溫下黑曲霉對刺傷紅提葡萄的致病規(guī)律研究及拮抗菌篩選

李麗梅，劉霞，李喜宏，楊鴻遠，趙亞婷

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.長融匯通（天津）食品科技研發(fā)有限公司，天津 300457）

霉菌侵染是引起生鮮葡萄采后霉變腐爛的主要原因。我國每年因此而導致的葡萄等大宗果蔬損失占其總產量的30%～40%左右[1]，尤其在常溫、亞常溫的運輸和銷售過程中，擠壓及機械傷口極易引起黑曲霉（Aspergillus niger）的大范圍的感染，即黑粉病，導致果蔬失去其食用價值和商品價值。

近年來，國內外研究更多地利用生物防治的方法來對葡萄等大宗果蔬進行保鮮，致力于篩選非致病微生物抑制某些致病致腐霉菌的生長和繁殖。范青等[2]研究發(fā)現(xiàn)季也蒙假絲酵母能夠抑制成熟的桃果實的軟腐病，成熟的桃果實用酵母菌細胞懸浮液處理后，在25℃條件下儲藏4 d，其軟腐病的發(fā)病率為零。Lucia Parafati等[3]研究證明釀酒酵母對葡萄采后灰霉病具有較好的防治作用。秦丹[4]篩選到一株季也蒙畢赤氏酵母對葡萄果實采后灰霉葡萄孢病害具有拮抗作用，并研制出拮抗酵母的生防制劑。

本試驗以紅提葡萄為試材，以黑曲霉為模式菌株，模擬常溫銷售過程中不同方式的機械傷及黑曲霉侵染方式對葡萄造成的病害程度，通過離體和活體雙重試驗，研究不同拮抗菌對黑曲霉采后病害及生物防治的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅提葡萄：天津市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)金元寶批發(fā)市場；拮抗菌株：天津科技大學食品科學與工程學院321實驗室自行分離于葡萄等果蔬表面，并保藏于-80℃條件下；黑曲霉：天津科技大學食品科學與工程學院321實驗室自行分離于葡萄表面，并保藏于-80℃條件下。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrost agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

營養(yǎng)酵母葡萄糖肉湯（nutrient yeast dextrost broth，NYDB）培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水 1 000 mL，121℃滅菌 20 min。

1.3 試驗儀器與設備

LB-BC58F高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；CBV-1500A無菌實驗臺：上海瑞仰凈化裝備有限公司；5804（R）冷凍離心機：德國 Eppendorf公司；JJ-1000精密型電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；BMJ-250C霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 黑曲霉的致病曲線研究

設置1 mm～2 mm、2 mm～3 mm、3 mm～4 mm 3個傷口刺破直徑，104、105、106spores/mL 3 個致病菌濃度，采用活體接種致病菌的方式模擬常溫銷售過程中的可能機械傷害[5]，通過定期測定病斑直徑確定最適的活體試驗接種參數(shù)。

1.4.2 拮抗菌對黑曲霉的生防效果研究

拮抗菌菌懸液的制備[6]：將分離的酵母菌接種于盛有40 mL營養(yǎng)酵母葡萄糖肉湯（NYDB）液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h～48 h，5 000 r/min離心10 min，收集酵母菌體細胞，用0.9%的無菌生理鹽水重新懸浮，血球計數(shù)器計數(shù)，用分光光度計配成濃度1.0×108CFU/mL～1.2×108CFU/mL的菌體懸浮液備用。

病原菌孢子的制備：病原菌于28℃下PDA平板培養(yǎng)4 d～6 d至孢子大量產生后，用0.9%無菌生理鹽水洗下病原菌孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，調節(jié)孢子濃度為 1×104spores/mL～1.2×104spores/mL，備用。

1.4.3 拮抗菌的生防效果離體試驗

采用濾紙片法測定拮抗菌對優(yōu)勢致病菌的離體拮抗效果。用移液槍吸取100 μL病原菌孢子懸浮液于平板上，并用涂布棒涂布均勻。在培養(yǎng)基上放置直徑為5.0 mm的濾紙片，用移液槍吸取10 μL的拮抗菌菌懸液于濾紙片上，每個平板放2個濾紙片，于28℃培養(yǎng)3 d～4 d后，采用十字交叉法用游標卡尺測量濾紙片周圍抑菌圈直徑[7]。

1.4.4 拮抗菌的生防效果活體試驗

葡萄果實的處理[8]：挑選大小、成熟度一致的果粒，用剪刀將葡萄果粒從葉莖上剪下，防止葡萄果粒干枯，每個葡萄果粒上留有5 mm的果梗[9]。將葡萄果粒浸入無菌的2%次氯酸鈉溶液中2 min，然后用無菌水沖洗，在無菌操作臺中晾干。

活體篩選：待葡萄果粒表面無水分殘留時，用無菌牙簽刺破果實胴部人為造成傷口[10]，傷口直徑3 mm～4 mm，深5 mm，每一傷口加入10 μL酵母菌培養(yǎng)液（108cfu/mL），2 h后，加入10 μL病原菌孢子懸浮液（104spores/mL），室溫（25℃）下放置 1 h，待果實風干至傷口邊緣無流動菌液后置于無菌培養(yǎng)皿蓋中，用保鮮膜進行密封，以30℃/93%濕度恒溫保濕培養(yǎng)，5 d～7 d后測量傷口病斑大小和腐爛率，對照組加入無菌水和對應的病原菌孢子懸浮液，每個處理6個平行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)利用Excel 2016軟件進行計算平均值和偏差，Origin pro 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同刺傷直徑對黑曲霉發(fā)病的影響

不同接種濃度對刺破傷口1 mm～2 mm時病斑直徑的影響見圖1。

圖1 不同接種濃度對刺破傷口1 mm～2 mm病斑直徑的影響Fig.1 Effects of different inoculation concentrations on lesion diameter of wound 1 mm-2 mm

葡萄常溫物流過程中尤其在果梗基部或是受機械傷害后極易受到黑曲霉快速接觸侵染[11]，引起黑粉病，導致葡萄組織非水漬狀腐爛、褐變。由圖1可知，傷口刺破直徑為1 mm～2 mm時，在接種2 d后，黑曲霉發(fā)病的病斑直徑變化較快，均呈現(xiàn)較好的線性關系。隨著接種濃度的增大，病斑直徑也呈線性增加，接種病原孢子濃度為106spores/mL時，病斑直徑在第5天最大，平均值為13.99 mm，與接種病原孢子濃度為105spores/mL處理組的病斑直徑無顯著性差異。

不同接種濃度對刺破傷口2 mm～3 mm時病斑直徑的影響見圖2。

圖2 不同接種濃度對刺破傷口2 mm～3 mm病斑直徑的影響Fig.2 Effects of different inoculation concentrations on lesion diameter of wound 2 mm-3 mm

由圖2可知，傷口刺破直徑為2 mm～3 mm時，1 d就呈現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，此后發(fā)病3個接種濃度的病斑直徑變化較一致，第5天時，病原孢子濃度106spores/mL時病斑直徑較其他兩組稍大，其平均病斑大小為16.85 mm。

不同接種濃度對刺破傷口3 mm～4 mm時病斑直徑的影響見圖3。

圖3 不同接種濃度對刺破傷口3 mm～4 mm病斑直徑的影響Fig.3 Effects of different inoculation concentrations on lesion diameter of wound 3 mm-4 mm

圖3結果表明，當傷口直徑3 mm～4 mm時，在接種量相同，接種濃度為105spores/mL時，5 d后病斑直徑最大，可能的原因是傷口內表面面積與病原菌孢子液接觸面有差異，傷口直徑較前兩個傷口直徑大，孢子液沒有完全覆蓋傷口，導致表面病斑直徑較小。比較圖1、圖2和圖3，病原孢子液濃度與傷口直徑均會影響到病斑直徑，接種濃度為105spores/mL、傷口直徑為3 mm～4 mm時，病斑變化最大并且在5 d后病斑直徑最大，病斑平均大小為20.30 mm。

2.2 拮抗菌的離體抑菌效果

在前期拮抗菌篩選中，拮抗酵母篩選方法參照李莉[10]的方法，得到了5株酵母，將其編號為YT-1、YT-2、YT-3、YT-4、YT-5。拮抗菌 YT－2 對黑曲霉的離體拮抗效果見圖4，5株拮抗菌對黑曲霉的離體拮抗效果見表1。

圖4 拮抗菌YT－2對黑曲霉的離體拮抗效果Fig.4 Antagonistic effect of antagonistic bacterium YT-2 on Aspergillus niger in vitro

表1 5株拮抗菌對黑曲霉的離體拮抗效果Table 1 Antagonistic effect of five antagonistic bacteria against Aspergillus niger in vitro

由表1的抑菌圈結果可知，5株酵母對黑曲霉均有不同程度的拮抗效果。對黑曲霉抑菌效果最好的是YT-2，其抑菌直徑為（15.76±1.79）mm，其次為 YT-3，抑菌圈直徑（15.42±2.87）mm。YT-4和YT-5抑菌效果相對較差，抑菌圈直徑僅為（11.23±1.14）mm和（11.23±3.21）mm。從圖4可以看出，YT-2拮抗菌的抑菌圈外緣并沒有明顯的無菌圈，由此可推測拮抗菌的抑菌機理可能為營養(yǎng)與空間競爭或其他，可能拮抗菌并沒有在體外分泌抗菌物質[12]，拮抗酵母的抑菌效果可結合活體試驗綜合評價拮抗菌的拮抗效果。

2.3 黑曲霉拮抗菌的活體抑菌效果

通過果實活體接種法，分別將前期分離到的5種拮抗菌與黑曲霉共同接種到果實傷口處。拮抗菌YT-2對黑曲霉的活體拮抗效果見圖5，5株拮抗菌對黑曲霉的活體拮抗效果見表2。

圖5 拮抗菌YT-2對黑曲霉的活體拮抗效果Fig.5 Antagonistic effect of antagonistic bacterium YT-2 on Aspergillus niger in vivo

從表2可以看出，拮抗菌培養(yǎng)后篩選到對黑曲霉有顯著抑菌效果的拮抗菌株YT-2，其次為YT-5，接種該菌株的葡萄果粒均沒有明顯黑粉病癥狀，但是病斑直徑分別為（3.20±0.46）mm 和（5.90±3.22）mm，顯著低于對照和其他菌株。從圖5中可以看出，接種YT-2菌株的試驗組病斑直徑比初始傷口直徑略大，并且傷口表面比較干燥及周圍葡萄果粒組織均較好，無黏稠軟爛現(xiàn)象，呈現(xiàn)愈合現(xiàn)象。原因可能是接種拮抗酵母后，拮抗酵母迅速繁殖，同時與病原菌競爭營養(yǎng)與生存空間，快速利用了傷口表面的營養(yǎng)物質并占據(jù)生存空間，導致病原菌失去營養(yǎng)物質和生存空間，無法生長繁殖以及產生有毒物質，從而在宏觀上抑制了病害的發(fā)生[13]。此外，可能是拮抗酵母在葡萄果實或者果實傷口的生長與繁殖能夠誘導果實自身抗性酶增加或者抗性酶活性增強，從而發(fā)揮拮抗作用[14]，YT-2與YT-3在離體篩選中也表現(xiàn)較強的抑菌效果，活體條件下，YT-2對黑曲霉抑制率為100%。

表2 5株拮抗菌對黑曲霉的活體拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of five antagonistic bacteria against Aspergillus niger in vivo

3 結論

通過離體和活體雙重試驗，篩選出采后黑曲霉病害的最佳拮抗菌為YT-2。研究得出模擬刺破傷口3 mm～4 mm，病原菌接種量105spores/mL時，病斑傷害最大，拮抗酵母菌對黑曲霉抑制效果最佳，離體抑菌直徑為（15.76±1.79）mm，活體條件下對黑曲霉抑制率為100%。拮抗酵母YT-2常溫下能夠有效抑制黑曲霉，顯著降低機械傷引起的微生物病害問題，抑制霉變。