CaSR986基因多態性與能譜CT泌尿系結石成分分析及臨床特征的相關性

李勤祥，潘愛珍，徐志鋒，金亞彬，劉偉濤，徐文鋒

（佛山市第一人民醫院，廣東 佛山 528000）

泌尿系結石是泌尿外科最常見疾病之一，近年，隨著人們生活環境及飲食習慣的不斷改變，其發病率有上升趨勢，且復發率也相對較高，給患者造成一定的困擾[1-2]。因此尋找相關原因，探求解決辦法一直是臨床工作者關注的重點。有研究顯示，泌尿系結石復發與結石成分密切相關，而后者又與基因遺傳學明顯相關，但具體基因分析研究較為少見[3]。鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR）基因位于人染色體3q13.3-21上，其編碼蛋白是一種重要的G蛋白偶聯受體，在鈣離子調節中占有重要地位[4]。CaSR基因共有7個外顯子，而CaSR986則是位于第7個外顯子中的某個單核苷酸，其主要功能是編碼細胞外域和跨膜的鈣敏感受體蛋白，可導致含鈣結石形成[5]。結石成分不同，其治療方法不盡相同，目前術后體外紅外光譜分析法是結石成分分析的金標準，限制了術前對結石成分的準確判斷從而影響個體化治療方案的制定，近年來能譜CT雙能量掃描可彌補此不足，可在體內完成此項檢查，為結石成分分析提供了一個新的平臺[6-7]。本研究選取我院收治的98例泌尿系結石患者和50例健康者作為研究對象，探討CaSR986基因多態性與泌尿系結石成分及臨床特征的相關性，旨在為臨床個體化治療提供更多理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2017年7月于我院收治的98例泌尿系結石患者作為研究對象，稱為實驗組，納入標準為：①臨床表現、實驗室及影像學檢查均提示為泌尿系結石，且為首次診療者；②年齡在18～50歲之間，且均須經皮腎鏡或輸尿管鏡取石術者；③術前行雙能源CT雙能量掃描，術后行紅外光譜分析者；④臨床及隨訪資料完整者。排除標準：①術前雙能CT和術后紅外光譜結果分析差異者；②懷孕者或合并泌尿系惡性腫瘤者；③期間或近半年參加相關研究者；④具有精神病史或家族史者；其中男56例，女42例；平均年齡（34.98±6.18）歲；地區分布：本地長期生活達10年者65例；其它33例。收集同期于我院進行體檢的50例健康者作為對照組，排除具有泌尿系結石家族史者；其中男28例，女22例；平均年齡（35.08±6.69）歲；地區分布：本地長期生活達10年者34例；其它16例。兩組在性別、年齡及地區分布等一般資料上差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 CaSR986基因多態性檢測

1.2.1 血液標本收集及保存

囑所有患者于入組當天抽取5 mL外周靜脈血（EDTA抗凝），3 000 r/min低溫高速離心10 min，轉移上清液至1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存，待所有標本集齊后進行后續檢測。

1.2.2 DNA提取

參考外周血基因組DNA提取試劑盒 （美國Merck公司）操作說明書完成DNA提取，后采用GENESYSTM180紫外分光光度儀（美國Thermo Fisher公司）檢測其濃度、純度，質量合格者進行后續實驗。

1.2.3 PCR引物設計

參考Gene Bank中CaSR基因中第7外顯子986突變位點上下游序列，使用Primer 6.0軟件完成引物設計，后由上海吉凱基因化學技術有限公司完成其合成和測序驗證，序列正確。其中上游引物序列為5’-CAGAAGGTCATCTTTGGCAGCGGCA-3’，下游引物序列為5’-TCTTCCTCAGAGGAAAGGAGTCTGG-3’。

1.2.4 PCR擴增

反應體系：①總體積50 μL；②內容物：4μLDNA模板、各4 μL上下游引物（0.5 μmol/L）、4 μL dNTP混合液 （200 μmol/L）、0.5 μLTaqDNA聚合酶（5U）、4 μL Mgcl2（1.5 mmol/L）及28.5 μL Buffer；③反應條件：按95℃10 min預變性、95℃30 s變性、60℃1 min退火、72℃1 min延伸，共40個循環，最后72℃ 10 min終末延伸。其中產物片段長度為450bp。

1.2.5 CaSR986基因多態性分析

參考PCR產物純化試劑盒（購于美國Merck公司）操作說明書完成PCR產物純化和回收，后將其送至上海吉凱基因化學技術有限公司測序。

1.3 結石成分分析

術前，采用寶石能譜 CT （Discovery CT 750HD，GE Healthcare）對實驗組患者體內結石進行檢查，掃描范圍為雙腎上極至恥骨聯合水平；掃描參數：GSI模式，掃描管電壓120 kVp，管電流150 mAs，探測器準直0.625 mm×64 mm，螺距0.984，球管轉速1 s/r，DFOV 12 cm，矩陣512×512。原始數據傳至GEAW 4.6工作站，由1名有多年工作經驗的放射科醫師在GSI模式下測量所有結石的有效原子序數（Eff-Z）。選取結石最大層面手工勾畫感興趣區（ROI），盡可能包含結石，依據Eff-Z峰值和能譜曲線按照國家標準與技術研究所（NIST）已知物質進行比較判定結石主要成分。術后，采用LIIR-20紅外光譜自動分析儀（天津藍莫德科學儀器有限公司）對實驗組患者取出結石進行成分分析。

在本研究中，主要將結石成分分為兩類：含鈣結石和非含鈣結石兩種類型。

1.4 隨訪

術后，對實驗組患者隨訪1年，每次間隔2月，主要通過電話、微信、上門和入院復查等方式進行。對疑似復發者囑其立即入院完成相關檢查，尤其強調行能譜CT復查其再發結石成分。

1.5 統計學方法

本研究所有數據均采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，其中基因頻率分布采用Hardy-Weinberg平衡檢驗；計數資料用構成比（%）描述，用χ2或Fisher精確檢驗比較；采用Pearson法分析CaSR986基因型分布與結石成分之間的關系；采用Logistic回歸法分析影響結石復發的獨立危險因素；按α=0.05的檢驗水準；以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

實驗組和對照組中發現CaSR986基因有AA、AS和SS三種基因型，以AA純合子基因型比較高；采用擬和優度卡方檢驗分析其基因頻率分布，符合Hardy-Weinberg定律（P>0.05），具有群體代表性。

2.2 兩組CaSR986基因多態性比較

CaSR986基因型及等位基因構成比在實驗組和對照組差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表1。

2.3 實驗組結石成分分析

在本研究中，實驗組含鈣結石75例（圖1），非含鈣結石23例（圖2）。

2.4 CaSR986基因型與結石成分相關性分析

經Pearson相關性分析得知，含鈣結石與CaSR986 AA型呈現明顯正相關（r=0.734，P<0.05）；而含鈣結石與CaSR986其它基因型、非含鈣結石與CaSR986任何基因型均無明顯相關性（P>0.05）。

2.5 CaSR986基因型與臨床特征之間的關系

CaSR986基因型分布在結石部位、結石復發及復發結石成分上差異具有統計學意義（P<0.05）：其中AA型與腎結石、AS型與膀胱結石及SS型與尿道結石相關性較大；AA型與結石復發及含鈣結石成分密切相關，但在結石直徑及腎積水方面差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表2。

2.6 泌尿結石復發Logistic回歸分析

將年齡、性別、結石部位、結石成分、結石直徑、腎積水情況及CaSR986基因型納入Logistic回歸分析發現：結石部位、結石成分及CaSR986基因型與泌尿結石復發相關（P<0.05），在校正性別及年齡混雜因素后再次進行Logistic回歸分析后發現結石成分是影響泌尿結石復發的獨立危險因素（P<0.05）。

表1 兩組CaSR986基因多態性比較

圖1，2 HDCT結石成分分析結果圖。圖1為含鈣結石（草酸鈣結石），圖2為非含鈣結石（尿酸結石）。Figure 1,2.The results of HDCT stone composition analysis.Figure 1:Calcium-containing calculus (calcium oxalate stone),Figure 2:Non-calcium stone(uric acid stone).

表2 CaSR986基因型與臨床特征之間的關系

3 討論

泌尿結石發生及復發機制截止目前仍不十分清楚，可能與環境因素、遺傳因素及個體因素等有關[8]。目前有學者認為遺傳因素在其中占有一定地位，且與結石成分相關[9]。CaSR基因可在人體各個組織中分布，以腎臟和甲狀旁腺為主，在感應細胞外鈣離子變化后通過介導甲狀旁腺激素 （Parathyroid hormone，PTH）釋放和促進腎小管細胞對鈣的吸收，在保證體內鈣平衡方面占有重要地位[10]。大部分學者認為腎臟鈣調節功能與泌尿系含鈣結石形成密切相關，進一步研究發現CaSR是影響尿鈣重吸收的重要基因之一，基因形態不同其相關性有所差異[11-12]。在CaSR基因第7個外顯子中包含3個單核苷酸（Single nucleotide polymorphisms，SNP），分別為986S、990G和1011Q，均可導致含鈣結石形成，基因多態性不同，可呈現不同結果[13]。能譜CT是近年來醫學影像學發展史上又一突破，可在治療前大致了解結石成分，為其治療方案的選擇提供了方向，有效提高了其治愈率[14]。

本研究則主要針對CaSR986基因，探討其多態性與能譜CT泌尿系結石成分分析結果及臨床特征的相關性。本研究完成了98例泌尿系結石和50例健康體檢者外周血血清的DNA測序，發現兩組CaSR986基因分布符合Hardy-Weinberg定律，且均以AA純合子最為常見，這與國內外主要觀點一致[15-16]。兩組CaSR986基因基因型及等位基因構成比比較差異無統計學意義（P>0.05），但經Pearson相關性分析得知，含鈣結石與CaSR986 AA型呈現明顯正相關 （r=0.734，P<0.05），提示含鈣結石形成與CaSR986基因密切相關，其具體調控機制未在本實驗中得到探討，有待后續繼續研究。此外，本研究通過分析CaSR986基因型與臨床特征之間關系發現CaSR986基因型分布在結石部位、結石復發及復發結石成分上差異具有統計學意義（P<0.05），提示臨床工作者可通過檢測患者CaSR986 SNP，幫助發現隱秘部位細小結石和預測患者預后，具有一定臨床價值。

最后，本研究還進行了泌尿結石復發Logistic回歸分析，發現結石成分是影響泌尿結石復發的獨立危險因素（P<0.05），提示臨床工作者應該關注泌尿系結石患者結石成分的準確分析，與前面結論聯合再次強調了基因多態性與寶石能譜CT聯合檢測在泌尿系結石診療及預后監測中的重要意義。

綜上所述，寶石能譜CT可在術前分辨含鈣結石，對泌尿結石復發預測具有一定價值，與CaSR986 AA基因型密切相關。