臭氧降解農殘后對花蛤營養價值的影響

田亞亞，劉敏軒，亢春雨，王向紅

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

已有很多學者證明采用臭氧去降解食品中的農藥殘留是可行的，如De Souza等[1]證明了用氣態臭氧或臭氧水，都可有效去除胡蘿卜中的苯醚甲環唑和利谷隆。在其他農產品中也已經證明了臭氧在農藥去除中的應用，如萵苣、葡萄、蘋果、檸檬、橙子、葡萄柚、玉米、小麥和荔枝[2-6]。而近些年來貝類的凈化及去除獸藥殘留也涉及到采用臭氧去處理，效果良好，得到各界的認可[7]。同時臭氧處理還可以降低貝類中的大腸桿菌群和細菌總數的數量[8]。臭氧技術正被廣泛應用于食品行業，而且2001年食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）將臭氧列入可直接和食品接觸的添加劑，為臭氧的應用帶來了廣闊的前景[9]。

臭氧是一種強的氧化劑[10]，可以有效去除農殘，同時O3是一種不穩定的分子，可快速衰變為雙原子氧，因此不會在食物中留下任何殘留物，故近年來被廣泛應用于去除食品中農藥殘留。O3對有機化合物的氧化可以通過O3分子與有機化合物的反應或O3分解形成的自由基與有機化合物的反應來發生。那么在臭氧發揮作用降解農藥殘留的同時，它的強氧化性是否也會對被降解的食品自身的營養價值產生影響，是否會使食品的營養成分被破壞，甚至造成營養流失，或者使食品的口感不好，變差，失去其原有的獨有性，本試驗選擇水產品中的花蛤來探究這一系列問題。

花蛤是我國近海四大養殖貝類之一，在我國南北沿海均有分布。其肉質鮮美，營養豐富，具有很高的食用價值和保健作用[11]。近幾年來，在我國遼寧、山東、福建等沿海省市的灘涂海域捕撈和養殖產量增長迅速，目前山東省養殖面積達到5萬多hm2，產量達100多萬噸，遼寧丹東東港市每年出口日本100 t～200 t[12]。花蛤由于其肉質鮮美等特點，深受廣大消費者歡迎，在夏季的大排檔餐桌上隨處可見花蛤的身影，而花蛤可被加工成多種產品。

很多學者已有研究證實臭氧確實可以有效去除食品中的農藥殘留，同時不會在食品中留下任何殘留物，但是臭氧的強氧化性是否對被降解的食品自身的營養價值產生不利影響，卻少有人研究。故本試驗的目的是要探究采用臭氧處理是否會對食品的營養價值產生影響——以花蛤為例，從水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、總糖、氨基酸組成、脂肪酸組成、礦物質、維生素九大方面對比花蛤的營養價值在臭氧處理前后是否發生變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花蛤：河北農大科技市場；石油醚、葡萄糖、蒽酮、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、硫酸銨、硝酸、無水乙醇、抗壞血酸、氫氧化鉀、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚、正己烷、丙酮、庚烷磺酸鈉、甲酸（以上均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜級）：邁瑞達公司；24種元素標準溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；維生素A、維生素E、維生素B2、維生素PP標準品：萬科有限公司；16種氨基酸標準品：上海安譜實驗科技股份有限公司；35種脂肪酸混合標準品：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 花蛤樣品的前處理

水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、總糖測定的樣品前處理方法為：向300 mL的蒸餾水中通入不同時間（0、3、5、10、20、30、60 min）的臭氧，制備成不同濃度（0、0.6、1.2、1.8、3.0、4.2、5.4 mg/L）的臭氧水。取適量花蛤放入不同濃度梯度的臭氧水中浸泡10 min后，去殼取肉備用。

氨基酸、脂肪酸、礦物質、維生素測定的樣品前處理方法為：向300 mL的蒸餾水中通入不同時間（0、30 min）的臭氧，制備成不同濃度（0、4.2 mg/L）的臭氧水。取適量花蛤放入不同濃度梯度的臭氧水中浸泡10 min后，去殼取肉備用。

1.3.2 水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、總糖的測定方法

水分的測定[13]：常壓直接干燥法；灰分的測定[14]：550℃灼燒質量法；粗脂肪的測定[15]：索氏抽提法；粗蛋白的測定[16-17]：微量凱氏定氮法；總糖的測定[18]：蒽酮比色法。

1.3.3 氨基酸組成的測定方法

氨基酸組成的測定，參照黃瑞等[19]的氨基酸自動分析法。

稱取混合均勻的適量樣品，在水解管中加入10mL～15 mL 6 mol/L鹽酸溶液，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3 min～5 min，充氮保護，擰緊瓶蓋，將水解管放在（110±1）℃的電熱鼓風恒溫箱中水解22 h后，取出，冷卻至室溫（20±5）℃。打開水解管，將水解液過濾至50 mL容量瓶中，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一50 mL容量瓶內，最后用水定容至刻度，搖勻。準確吸取1.0 mL濾液移入至15 mL試管內，40℃減壓至干，用1.0 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖溶液附溶，振蕩混勻后，過0.22 μm濾膜后，上機測定。

儀器條件：色譜柱：磺酸型陽離子樹脂；波長：570 nm 和 440 nm；進樣量：500 μL，流速：3 mL/min；反應溫度：（135±5）℃。

1.3.4 脂肪酸組成的測定方法

1）脂肪酸組成的測定：參照劉哲、莊柯瑾等[20-21]的氣相色譜方法。

2）試樣水解：稱取均勻試樣適量，加入約100 mg焦性沒食子酸，加入幾粒沸石，再加入2 mL 95%乙醇，混勻。加入鹽酸溶液10 mL，混勻。將燒瓶放入70℃～80℃水浴中水解40 min。每隔10 min振蕩一下燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫（20±5）℃。

3）脂肪的提取：水解后的試樣，加入10 mL 95%乙醇，混勻。將燒瓶中的水解液轉移到分液漏斗中，用50 mL乙醚石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋。振搖5 min，靜置10 min。將醚層提取液收集到250 mL燒瓶中。按照以上步驟重復提取水解液3次，最后用乙醚石油醚混合液沖洗分液漏斗，并收集到已恒重的燒瓶中，將燒瓶置水浴上蒸干，置（100±5）℃烘箱中干燥2 h。脂肪的皂化和脂肪酸甲酯化：在脂肪提取物中，繼續加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，85℃水浴鍋中水浴30 min，加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，于85℃水浴鍋中水浴30min。水浴完成后，等溫度降到室溫（20±5）℃，在離心管中加入1 mL正己烷，震蕩萃取2 min之后，靜置1 h，等待分層。取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL。用0.45 μm濾膜過膜后上機測試。

4）氣相色譜條件：色譜柱：CD-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；升溫程序：130℃保持 5 min，以 4℃/min的速率升溫至240℃，保持30 min。進樣口溫度：250℃；載氣流速：0.5 mL/min；分流進樣，分流：10 ∶1；檢測器：火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，FID）；檢測器溫度：250℃。

1.3.5 礦物質的測定方法

礦物質的測定，參照任紅等[22]的電感耦合等離子體發射光譜法/電感耦合等離子體質譜法。

稱取適量花蛤肉樣品至聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。靜置，反應結束后，蓋蓋密封，放入微波消解儀。消解程序：（1）100℃保持 3 min，（2）1 040℃保持3 min，（3）160 ℃保持 3 min，（4）180 ℃保持 3 min，（5）190℃保持15 min。

待溫度冷卻至50℃以下后，取出消解罐放入通風櫥中，打開消解罐，用超純水潤洗，轉移至50 mL容量瓶中，至少潤洗3次～4次，用超純水稀釋定容至刻度，待測。空白對照同法處理。

電感耦合等離子體發射光譜儀（測定的元素：鉀、鈣、鈉、鎂、磷、鐵）參數：射頻功率：1 150 W；輔助氣流速：0.5 L/min；泵速：45 rpm；冷卻器流速：12 L/min；采樣深度：5 mm。

電感耦合等離子體質譜儀（測定的元素：錳、鋅、銅、硒）參數：射頻功率：1 550 W；泵速：40 r/min；霧化室溫度：2.7℃；采樣深度：5 mm；冷卻氣流速：14 L/min；輔助氣流速：0.8 L/min；霧化氣流速：1.122 L/min。

1.3.6 維生素的測定方法

1）維生素A、維生素E的測定：參考黃旭等[23]的高效液相色譜法。

2）標準儲備液的配制：準確稱取適量標準品維生素A、維生素E用無水乙醇溶解使其濃度為1.0 mg/mL。混合標準系列工作溶液的配制：分別準確吸取維生素A和維生素E標準儲備液，配制成維生素A和維生素E的混合標準系列工作溶液，使其濃度為維生素A：0.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L；維生素 E：5.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。

3）樣品前處理：準確稱取均質后的樣品10 g（精確至0.01 g）于250 mL棕色碘量瓶中，依次加入20 mL、1 g抗壞血酸、50 mL無水乙醇、5 g氫氧化鉀，充分搖勻，慢慢向瓶底部沖入氮氣，將瓶口蓋緊密封，放置于恒溫水浴鍋中，85℃水浴邊振蕩邊進行皂化反應30 min。反應完全后，將溶液放置至室溫（20±5）℃，用水將全部皂化液轉移到100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。然后準確移取20.0 mL皂化液至固相萃取柱，洗脫液收集于100 mL棕色容量瓶中，重復5次。最后使用正己烷定容至刻度，搖勻備用。準確移取上述洗脫液10.0 mL，放入離心管中，于40℃下氮吹近干，使用乙醇復溶并定容至2.0 mL，將此溶液過0.45 μm后，上機測定。

4）色譜條件：色譜柱：SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：純甲醇，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL，柱溫：38 ℃，檢測波長為維生素 A：325 nm，維生素E：294 nm。

5）維生素B2、維生素PP的測定：參考黃榮榮等[24]的高效液相色譜法。

6）標準溶液的配制：準確稱取0.100 0 g煙酸標準品，加水溶解后，轉移至棕色容量瓶中，并定容至100mL，配制成濃度為1 mg/mL的貯備液。準確稱取0.025 0 g維生素B2標準品，置于100 mL棕色容量瓶中，加入2 mL（1∶1，體積比）鹽酸溶液，溶解后，用水定容至刻度。混合標準系列工作溶液的配制：分別準確吸取維生素 PP 標準溶液 5、10、50、100、250 uL，維生素 B2標準溶液 20、40、200、400、1 000 uL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，配制成維生素PP和維生素B2的混合標準系列工作溶液，濃度為維生素PP/B2：0.5、1.0、5.0、10、25 mg/L。

7）樣品前處理：準確稱取1.00 g試樣，加入15 mL水，混勻后，超聲10 min，移入25 mL棕色容量瓶中，加入2.5 mL丙酮，用水定容，搖勻。取出2 mL溶液，離心，上清液過0.45 μm膜后，待測定。

8）色譜條件：色譜柱：SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A：純甲醇，B：0.1%庚烷磺酸鈉（甲酸調節pH 2.5），梯度洗脫參數見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；波長：261 nm。梯度洗脫參數見表1。

表1 梯度洗脫參數Table 1 Gradient elution parameter

2 結果與分析

2.1 臭氧降解對花蛤中水分的影響

通入不同時間臭氧時對花蛤中水分的影響見表2。

表2 通入不同時間臭氧時花蛤樣品中分水含量Table 2 Water content in color clams when ozone is introduced at different times

臭氧通入蒸餾水中的時間不同，制得不同濃度的臭氧水。由不同濃度的臭氧水去處理花蛤樣品后，通過顯著性差異分析得，Sig=0.329＞0.05，故臭氧通入時間對花蛤樣品中的水分含量無顯著影響，所以花蛤樣品中的水分含量在臭氧降解前后沒有顯著的差異。

2.2 臭氧降解對花蛤中灰分的影響

通入不同時間臭氧時對花蛤中灰分的影響見表3。

表3 通入不同時間臭氧時花蛤樣品中灰分含量Table 3 Ash content in color clams when ozone is introduced at different times

同樣制得不同濃度的臭氧水去處理花蛤樣品，比較表3中的數據，臭氧通入時間為0 min，即用蒸餾水去浸泡花蛤樣品10 min后，再去測定樣品的灰分含量，為1.98%。而用不同濃度的臭氧水降解后測得的樣品灰分含量，與0 min測得的數據在數值上相差不大，通過顯著性差異分析得Sig=0.267＞0.05，故臭氧通入時間對花蛤樣品中的灰分含量沒有顯著影響。所以臭氧降解農殘的過程中對花蛤樣品的灰分含量沒有較大影響。

2.3 臭氧降解對花蛤中粗脂肪的影響

通入不同時間臭氧時對花蛤中粗脂肪的影響見表4。

表4 通入不同時間臭氧時花蛤樣品中粗脂肪含量Table 4 Crude fat content in color clams when ozone is introduced at different times

沒有用臭氧降解的花蛤樣品的粗脂肪含量占濕重的1.30%，占干重的9.12%。而用不同濃度的臭氧降解后的花蛤樣品的粗脂肪含量略用增加。但通過顯著性差異分析，發現Sig=0.066＞0.05，臭氧通入時間對花蛤樣品中的粗脂肪含量（濕重）沒有顯著影響，Sig=0.233＞0.05，臭氧通入時間對花蛤樣品中的粗脂肪含量（干重）沒有顯著影響。故臭氧降解農殘的過程中對花蛤樣品的粗脂肪含量沒有較大影響。

2.4 臭氧降解對花蛤中粗蛋白的影響

通入不同時間臭氧時對花蛤中粗蛋白的影響見表5。

表5 通入不同時間臭氧時花蛤樣品中粗蛋白含量Table 5 Crude protein content in color clams when ozone is introduced at different times

從表5可以得出，未用臭氧降解的花蛤樣品中粗蛋白含量為12.58%，用不同濃度的臭氧降解后的花蛤樣品的粗蛋白含量與降解前相比，有增加有減少，但變化不是很明顯，通過顯著性差異分析，得Sig=0.125＞0.05，故臭氧通入時間對花蛤樣品中的粗蛋白含量沒有顯著影響。所以用臭氧降解農殘的過程中對花蛤中的粗蛋白含量沒有明顯影響。

2.5 臭氧降解對花蛤中總糖的影響

通入不同時間臭氧時對花蛤中總糖的影響見表6。

表6 通入不同時間臭氧時花蛤樣品中總糖含量Table 6 Total sugar content in color clams when ozone is introduced at different times

由表6可得，未用臭氧降解前花蛤樣品中總糖含量為2.49%，用不同濃度的臭氧降解后的花蛤樣品的總糖含量都略有減少，但通過顯著性差異分析得，Sig=0.100＞0.05，臭氧通入時間對花蛤樣品中的總糖含量沒有顯著影響。故用臭氧降解農殘過程中對花蛤中的總糖含量無較大影響。

2.6 臭氧降解對花蛤中氨基酸組成的影響

花蛤中各氨基酸含量在臭氧降解前后的對比見圖1。

圖1 花蛤中各氨基酸含量在臭氧降解前后的對比圖Fig.1 Comparison of amino acid content in color clams before and after ozone degradation

本試驗共測定了花蛤樣品中的16種氨基酸的含量。其中，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸為測定中的6種必需氨基酸，其總量在臭氧降解前為2.75 g/100 g，降解后為2.77 g/100 g，略有上升。對于花蛤而言，鮮味為其特有的，而決定鮮美程度的包括呈味氨基酸的組成和含量。其中通過圖1也可以看出，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸的含量相對于其他氨基酸為較多。這5種氨基酸屬于鮮味氨基酸[25-26]，含量由5.47 g/100 g下降到5.26 g/100 g（相對誤差為3.84%），略有下降。其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鮮味的特征氨基酸，樣品中二者的含量也是最高的，臭氧降解前分別為：1.70 g/100 g和1.75 g/100 g，臭氧降解后為：1.61 g/100 g（相對誤差為5.29%）和1.63 g/100 g（相對誤差為6.86%），兩種氨基酸的含量都略有減少。通過顯著性差異分析，同樣得出，天冬氨酸的Sig=0.042<0.05，故臭氧通入時間對花蛤樣品中的天冬氨酸的含量有顯著影響，而谷氨酸的Sig=0.020<0.05，所以臭氧通入時間對花蛤樣品中的谷氨基酸的含量也有顯著影響。這可能是由于天冬氨酸和谷氨酸都是酸性氨基酸，其結構式中都含有兩個羧基，而臭氧有強的氧化性，可能將羧基氧化了，導致這兩種氨基酸的含量減少。而甘氨酸和丙氨酸是呈甘味的特征氨基酸，樣品中二者的含量臭氧降解前分別為0.72 g/100 g和0.72 g/100 g，臭氧降解后分別為0.71 g/100 g（相對誤差為1.39%）和0.70 g/100 g（相對誤差為2.78%），這兩種氨基酸降解前后的變化不大，顯著性差異分析同樣也未得出有顯著性影響。而精氨酸的含量，臭氧降解前后分別為：0.58 g/100 g和0.61 g/100 g（相對誤差為4.92%），略有增加。整體而言，臭氧降解農殘的過程中會對花蛤中的氨基酸有一定的影響，如必需氨基酸會上升，而鮮味氨基酸略有下降，但是都在可接受的范圍內（相對誤差小于6.86%），不會對食用產生較大的影響。

2.7 臭降解對花蛤中脂肪酸組成的影響

花蛤中脂肪酸含量在臭氧降解前后的對比見圖2。

圖2 花蛤中各脂肪酸含量在臭氧降解前后的對比圖Fig.2 Comparison of fatty acid content in color clams before and after ozone degradation

通過氣相色譜法測定花蛤中的脂肪酸，共發現了26種脂肪酸。其中飽和脂肪酸有10種，不飽和脂肪酸有16種，不飽和脂肪酸的含量占脂肪酸總量的57.5%。從圖2數據中可得，脂肪酸的含量在臭氧降解農殘的過程中都會受到略微的影響，其中不飽和脂肪酸受到的影響可能要大于飽和脂肪酸。且不飽和脂肪酸中雙鍵的個數越多，受到的影響越大。但也有些不飽和脂肪酸的含量是增加的，如C24：1和C18：2n6c的含量，由降解前的0.000 9 g/100 g和0.013 0 g/100 g，上升為0.001 0 g/100 g和0.013 5 g/100 g。故不可說臭氧降解農殘的過程中對花蛤中的脂肪酸都是起降解的作用，反而有些脂肪酸的含量是增加的。出現這樣的現象可能是某些不飽和脂肪酸降解后恰好又形成了另一種脂肪酸，從而導致了有些脂肪酸的含量反而增加。整體而言，臭氧降解農殘對花蛤的脂肪酸這一方面可能會起到一些降解的作用，但測定的26種脂肪酸中只有5 種（C22：6n3、C20：6n3、C16：1、C24：0、C16：0）脂肪酸的含量在臭氧降解前后有顯著性差異，其他沒有顯著性差異。且其相對誤差均小于9.17%，在可接受的范圍內。

2.8 臭氧降解對花蛤中礦物質的影響

花蛤中礦物質含量在臭氧降解前后的對比見圖3。

花蛤中主要的礦物質有 K、Ca、Na、Mg、P、Fe、Mn、Zn、Cu、Se這10種，從圖3中可以看到，用通入30 min臭氧制得的臭氧水去處理的花蛤與未用臭氧水處理的花蛤相比，各礦物元素的含量沒有較大差異。但有些元素的含量是有下降的，也有些是上升的。如鉀的含量由1.85×103mg/kg下降為1.59×103mg/kg，鈉的含量由3.72×103mg/kg下降為3.60×103mg/kg，而鈣的含量卻是由1.01×103mg/kg上升為1.16×103mg/kg。雖然各礦物元素有細微的差異，但有顯著性差異的是Fe元素和Mn元素，這可能是由于臭氧在降解農殘的過程中，這兩種元素被氧化所造成的。

圖3 花蛤中各礦物元素含量在臭氧降解前后的對比圖Fig.3 Comparison of the content of various mineral elements in color clams before and after ozone degradation

2.9 臭氧降解對花蛤中維生素的影響

花蛤中維生素含量在臭氧降解前后的對比見圖4。

圖4 花蛤中各維生素含量在臭氧降解前后的對比圖Fig.4 Comparison of vitamins content in color clams before and after ozone degradation

花蛤中維生素含量豐富，其中維生素A、維生素E、維生素B2、維生素PP的含量較高，故選擇測定了這4種維生素在臭氧降解前后含量的對比。由測定的結果可得，維生素A、維生素E的含量，臭氧降解后的含量要比臭氧降解前的含量略低，通過顯著性差異分析，同樣可以得出，維生素A的Sig=0.020<0.05，即臭氧通入時間對花蛤樣品中的維生素A含量有顯著影響，而維生素E的Sig=0.026<0.05，即臭氧通入時間對花蛤樣品中的維生素E含量也有顯著影響，但其相對誤差均<10%。而維生素B2和維生素PP的含量在臭氧降解前后沒有顯著性差異。故可認為采用臭氧去降解農殘的這個過程中對花蛤自身的維生素含量有一定影響，但也在可接受的范圍內。

3 結論

采用臭氧降解農殘的過程中，對花蛤樣品中的水分含量無顯著影響，無臭氧處理組的花蛤樣品的水分含量為80.85%，用通入時長為60 min的臭氧水處理組的花蛤樣品的水分含量為81.5%。同樣對花蛤樣品的灰分含量、粗脂肪含量、粗蛋白含量、總糖含量都無較為顯著的影響。對比經過臭氧處理的花蛤樣品和未經過臭氧處理的花蛤樣品，發現：必需氨基酸的含量由2.75g/100g上升為2.77g/100g，鮮味氨基酸的含量由5.47 g/100 g下降為5.26 g/100 g（相對誤差為3.84%）。對脂肪酸的影響顯著，尤其是不飽和脂肪酸。10種礦物質和4種維生素的含量在臭氧降解前后，有些有顯著性差異，但也在可接受的范圍內。整體而言，在用臭氧降解農殘的過程中，并不會對花蛤樣品的九大營養方面產生明顯的影響（相對誤差均小于10%），故不會出現所擔心的營養成分被破壞，造成營養的流失。同時對花蛤而言，也不會出現鮮味變弱，口感變差的現象。但采用臭氧處理，卻可以有效去除食品中的一些有毒有害的農、獸藥的殘留，也可以明顯地降低一些致病菌。