香菇多糖脫蛋白工藝及其抗氧化活性研究

（江蘇農牧科技職業學院動物藥學院，江蘇泰州225300）

香菇又稱為香菌、花菇、香蕈，是一種藥食同源的中藥材。香菇的有效成分主要包括香菇多糖、香菇嘌呤、微量元素等[1]，其中香菇多糖是香菇的主要活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤和抗病毒等作用[2-6]。香菇中多糖與蛋白質共存，兩者均是香菇細胞的重要組分。熱水浸提法等方法在提取出香菇中的水溶性多糖類成分的同時，部分熱穩定性強的蛋白質及其它水溶性成分也會一起轉移至提取液中。目前，傳統的Sevag法、離子交換色譜法及酶法等多糖脫蛋白工藝復雜，效率不高[7-8]。低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是一種環境友好型的類離子液體，具有性質穩定、選擇性強、價格低廉等優點，并在天然產物、金屬離子、有機物等分離領域顯示出良好的應用前景[9-11]。本文采用DES與無機鹽溶液構成雙水相體系（aqueous twophase system，ATPS），為香菇多糖脫蛋白質提供一種新型有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：西峽縣雷氏菇品購銷有限公司。將香菇烘干、粉碎，過20目篩，備用。

無水葡萄糖對照品、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250：國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器：國華電器有限公司；XMTD-8222電熱恒溫鼓風干燥箱：上海姚氏儀器設備廠；SHZ-DⅢ循環水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；HK-02A多功能粉碎機：上海燁昌食品機械有限公司；80-2臺式電動離心機：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

2 試驗方法

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

參照文獻[12]，以無水葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸顯色法測定多糖的濃度，以吸光度（y）對葡萄糖濃度（x）回歸，得回歸方程為y=0.014 2x-0.006 9（R2=0.996 5），表明在 10.56 μg/mL～52.8 μg/mL 范圍內葡萄糖濃度與其吸光度呈良好的線性關系。

2.2 考馬斯亮藍標準曲線的繪制

參照文獻[13]，以牛血清白蛋白為對照品，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量。以蛋白質濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A595）為縱坐標，得回歸方程y=0.003 49x-0.005 53（R2=0.995 6），表明在 43.42 μg/mL～203.02 μg/mL范圍內蛋白質濃度與其吸光度呈良好線性關系。

2.3 香菇多糖水提液的制備

稱取香菇粉35 g，加500 mL蒸餾水，50℃水浴攪拌提取約2 h，抽濾得到香菇多糖水提液，4℃保存。

2.4 香菇多糖水提液中蛋白質含量測定

精密移取2.00mL香菇多糖水提液，按照2.2進行測算，得出香菇多糖水提液中蛋白質濃度為151.44μg/mL。以下試驗均采用此濃度的香菇多糖水提液。

2.5 低共熔溶劑DES的合成

參考文獻[14]，分別合成 DES 1[氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g）和尿素（0.2 mol，12.012 g）]、DES 2[（氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g） 和甲基脲 （0.2 mol，14.816 g）]、DES 3[（氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g）和丙三醇（0.2 mol，18.418 g）]、DES 4[（氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g）和乙二醇（0.2 mol，12.414 g）]4 種低共熔溶劑。

2.6 K2HPO4溶液的配制及DES-鹽雙水相體系的構建

稱取一定量K2HPO4溶于50 mL蒸餾水中，配制成不同濃度的K2HPO4溶液。向試管中加入一定量的DES，再加入適量K2HPO4溶液，充分振蕩、混合后，靜置，觀察是否成為清晰的兩相，研究體系成相規律。

2.7 蛋白質的脫除及含量測定

向刻度離心管中加入3 mL DES、3 mL K2HPO4溶液及2 mL香菇多糖水提液，2 000 r/min離心萃取30 min。操作結束后，將離心管取出，待兩相完全分離后，分別讀取上相和下相的體積，并用苯酚-硫酸顯色法和考馬斯亮藍法分別測定上、下兩相中多糖和蛋白質的濃度。

蛋白質的脫除率（E）按式（1）計算。

式中：ct1和cb1分別為萃取完全后蛋白質在上相（DES相）和下相（無機鹽相）中的濃度，μg/mL；Vt和Vb分別為雙水相上相和下相的體積，mL；R為該雙水相體系上下相體積比。

香菇多糖回收率（Y）按式（3）計算。

式中：ct2和cb2分別為萃取完全后多糖在上相（DES相）和下相（無機鹽相）中的濃度，μg/mL；Vt和 Vb分別為雙水相上相和下相的體積，mL。

2.8 香菇多糖抗氧化活性研究

采用DPPH法[15-18]，準確移取1.00 mL脫蛋白后的香菇多糖溶液，加入預先配置好的4 mL 0.15 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）甲醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其在515 nm波長處測定其吸光度A，同時測定樣品溶液在515 nm處的吸光度A0及DPPH甲醇溶液在515 nm處的吸光度A1，每個樣品重復3次。

3 結果與分析

3.1 DES種類的篩選

將氫鍵受體（氯化膽堿）與氫鍵供體（尿素、甲基脲、丙三醇、乙二醇）按照物質的量之比1∶2合成4種低共熔溶劑，與0.5 g/mL K2HPO4溶液組成雙水相體系，成相效果如圖1所示。

圖1DES-K2HPO4成相圖Fig.1 Photo of Four DES-K2HPO4aqueous two-phase systems

據圖1可知，試管1（氯化膽堿/丙三醇DES 1-K2HPO4）和試管 4（氯化膽堿/尿素 DES 4-K2HPO4）成相效果較好。

按2.7方法，比較4種DES構建的雙水相對香菇多糖水提液中蛋白質的脫除率，結果見表1。

表1 DES種類對蛋白質分配系數和脫除率的影響Table 1 Effect of DES types on protein partition coefficient and removal rate

由表1可知，相同條件下，DES 1（氯化膽堿/丙三醇）雙水相對香菇多糖蛋白質的脫除率最高，最高脫除率可達85.41%，且DES 1-K2HPO4成相效果較好，由此，在后續試驗中選用DES 1（氯化膽堿/丙三醇）構建雙水相。

3.2 雙水相體系成相規律

3.2.1 K2HPO4濃度對雙水相體系的影響

向3 mL氯化膽堿/丙三醇（物質的量之比1∶2）DES中加入3 mL不同濃度的K2HPO4溶液。當K2HPO4濃度由0.3 g/mL增加到0.8 g/mL時，上相（含DES）體積（Vt）逐漸變少，下相（含K2HPO4）體積（Vb）逐漸增加，上下相體積比R（Vt/Vb）顯著減小。結果見圖2。

圖2 K2HPO4濃度對雙水相體系的影響Fig.2 Effect of K2HPO4concentration on aqueous two-phase system

3.2.2 DES加入量對雙水相體系的影響

向 K2HPO4溶液（0.5 g/mL，3 mL）中加入一定量的氯化膽堿/丙三醇（物質的量之比1∶2）DES，當DES加入量由1.8 mL增加至3.8 mL時，富含DES的上相體積（Vt）逐漸增大，富含下相無機鹽的體積（Vb）逐步減少，上下相體積比R逐漸變大，結果見圖3。

圖3 DES加入量對雙水相體系的影響Fig.3 Effect of DES addition on aqueous two-phase system

由圖3可見，K2HPO4的濃度和DES的加入量對雙水相成相體系有影響，進而對蛋白質的脫除率有影響。因此可以通過調節K2HPO4的濃度和DES的加入量來獲得滿意的脫除率。

3.3 單因素試驗

3.3.1 氯化膽堿/丙三醇物質的量比對蛋白質脫除率的影響

以 DES 1（3 mL）與 K2HPO4（0.5 g/mL，3 mL）構建雙水相體系，向其中加入香菇多糖水提液2.00 mL，2 000 r/min離心30 min，DES1物質的量比對雙水相體系中香菇多糖蛋白質萃取行為的影響如表2所示。

由表2可知，蛋白質在雙水相體系分配系數K1大多超過1，而香菇多糖在雙水相體系分配系數K2較小，說明蛋白質富集在上相，多糖富集在下相。在K2HPO4和香菇多糖水提液的量一定時，當氯化膽堿/丙三醇物質的量比為1∶2時，香菇多糖蛋白質擁有最大的脫除率，可達87.09%。在后續的單因素試驗中，選用氯化膽堿/丙三醇（物質的量之比1∶2）制備低共熔溶劑。

表2 DES 1物質的量比對E、Y的影響Table 2 Effect of the ratio of DES 1 substance on E and Y

3.3.2 K2HPO4溶液濃度對蛋白質脫除率的影響

以DES 1（物質的量之比1∶2，3 mL）與K2HPO4（3 mL）構建雙水相體系，向該體系中加入2mL香菇多糖水提液，離心參數設置同3.3.1，K2HPO4溶液的濃度對該雙水相體系中的香菇多糖蛋白質脫除率的影響如表3所示。

表3 K2HPO4溶液濃度對E、Y的影響Table 3 Effect of K2HPO4solution concentration on E and Y

由表3可知，當K2HPO4濃度在0.3 g/mL～0.6 g/mL范圍內，隨著其濃度的增加，蛋白質的脫除率隨之增高，這是因為下相空間的緊密度會影響蛋白質的脫除率，從而促進蛋白質進入到上相DES相中[14]。當K2HPO4濃度為0.6 g/mL時香菇多糖蛋白質擁有最大的脫除率，可達87.84%。K2HPO4濃度超過0.6 g/mL時，隨著K2HPO4濃度的增加，脫除率反而下降，這是因為過高濃度的K2HPO4，導致了部分蛋白質變性[19]。另外，處在下相的K2HPO4與位于上相的DES相互競爭水分子，DES中的含水量逐漸下降，導致蛋白質的脫除率下降。在后續的單因素試驗中，將K2HPO4的濃度確定為0.6 g/mL。

3.3.3 DES加入量對蛋白質脫除率的影響

以DES1（物質的量之比1∶2）與K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL）構建雙水相體系，香菇多糖水提液的加入量為2 mL，按照2 000 r/min的轉速離心萃取30 min，研究DES的加入量對雙水相體系中香菇多糖蛋白質萃取行為的影響，數據處理結果如表4所示。

表4 DES加入量對E、Y的影響Table 4 Effect of DES addition on E and Y

由表4可知，當DES的加入量在1.8 mL～2.6 mL范圍內，隨著DES量的增加，香菇多糖蛋白質的脫除率逐漸上升，這是因為DES簇集體的形成逐漸增多[13]，有利于蛋白質的萃取。當DES的加入量超過2.6 mL時，繼續增加DES的量，脫除率沒有明顯上升，所以在后續單因素試驗中，DES的加入量為2.6 mL。

3.3.4 萃取時間對蛋白質脫除率的影響

以 DES 1（物質的量之比 1 ∶2，2.6 mL）與 K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL）構建雙水相體系，向其中加入2 mL香菇多糖水提液，離心機的轉速固定為2 000 r/min。研究離心萃取時間對雙水相體系中香菇多糖蛋白質萃取行為的影響，數據處理結果和香菇多糖蛋白質的脫除率隨萃取時間的變化關系如表5所示。

表5 萃取時間對E、Y的影響Fig.5 Effect of extraction time on E and Y

由表5可知，當萃取時間由15 min增加到30 min時，香菇多糖蛋白質的脫除率呈上升趨勢，繼續增加萃取時間，香菇多糖蛋白質的脫除率E基本持平，未出現明顯增加，多糖回收率Y始終維持在較高水平。結果表明：萃取時間為30 mim時，香菇多糖蛋白質幾乎萃取完全，繼續增加萃取時間，對提升脫除率無明顯影響。

3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以DES 1物質的量比（A）、K2HPO4濃度（B）、DES加入量（C）、萃取時間（D）為因素，采用L9（34）正交進行試驗，正交設計見表6，所得結果見表7。以蛋白質脫除率為指標，優化萃取最佳工藝參數。

表6 正交試驗因素水平表Table 6 Horizontal table of factors in orthogonal test

表7 正交試驗結果與分析Table 7 Orthogonal test results and analysis

由極差R分析可知，4個因素對香菇多糖蛋白質脫除率的影響程度大小為：A（DES物質的量比）＞C（DES量）＞B（無機鹽濃度）＞D（萃取時間）。氯化膽堿/丙三醇低共熔溶劑與K2HPO4組成的雙水相體系萃取香菇多糖蛋白質最優試驗條件為A2B2C2D2，即DES物質的量比 1 ∶2、0.6 g/mL K2HPO43 mL，2.6 mL DES，萃取時間30 min。

3.5 驗證試驗

在A2B2C2D2條件下進行DES-K2HPO4雙水相體系脫除香菇多糖中蛋白質的驗證試驗，試驗結果見表8。

表8 驗證試驗Table 8 Demonstration test

據表8可知，在A2B2C2D2條件下蛋白質平均脫除率高達90.8%，多糖平均回收率為98.0%。與表5在同等水平下所得脫除率及回收率相近，表明該條件下試驗結果可靠。

3.6 香菇多糖DPPH自由基清除能力

香菇多糖對DPPH自由基的清除作用見圖4。

圖4 香菇多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of lentinan on DPPH free radical

由圖4可知，在脫蛋白的香菇多糖水提液的質量濃度為2.4 mg/mL時，隨著稀釋倍數的增大，DPPH自由基清除率逐漸減小，即在一定濃度范圍內，DDPH自由基清除率隨著香菇多糖質量濃度的增大而升高。

4 結論

本文通過熱水提取法制備香菇多糖溶液，采用低共溶劑（DES）-K2HPO4雙水相體系（ATPS）將香菇水提液中的多糖與蛋白質進行分離萃取研究，通過單因素試驗及正交試驗，得出香菇多糖水提液蛋白質脫除的最優工藝參數：以氯化膽堿/丙三醇（物質的量之比1 ∶2，2.6 mL）、K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL） 構建雙水相體系，加入2 mL香菇多糖水提液，萃取30 min后對香菇多糖蛋白質的脫除率高達90.8%，香菇多糖回收率為98.0%。脫蛋白后的香菇多糖具有較好的清除能力，且清除能力隨著香菇多糖質量濃度的增大而升高。

傳統脫蛋白的方法主要有sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等，這類方法需消耗大量的有機溶劑，或需在低溫下進行，對操作環境要求較高。而將DES與無機鹽構成的雙水相體系，萃取溫度接近室溫20℃，操作條件簡單，無污染，蛋白質萃取率（脫除率）及多糖回收率均能達到較高的水平，是一種綠色的萃取方法。