竹葉抗氧化物結合殼聚糖對青魚片貯藏品質的影響

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300）

青魚（black carp）又名黑鯇、螺螄青，屬鯉形目、鯉科的雅羅魚亞科。主要分布于我國長江以南的平原地區，是長江中、下游和沿江湖泊里的重要漁業資源，2014年全國養殖產量約為55.7萬噸，為我國淡水養殖的“四大家魚”之一[1]。青魚肉質鮮美肥膩，含有豐富的蛋白質、脂肪和礦物質，但宰殺后由于其營養豐富，極易發生腐敗變質，因此尋求行之有效的保鮮技術具有重要的研究意義[2]。

近年來，由于天然生物保鮮劑具有安全、高效和方便等特點，已成為農產品、肉品、水產品等品質保鮮的研究熱點[3]。竹葉抗氧化物（bamboo leaf antioxidants，AOB）是從竹葉中提取的抗氧化性成分，有效成分包括黃酮類、內酯類和酚酸類化合物，于2004年列入GB2760-1996《食品添加劑使用衛生標準》，允許其作為天然食品抗氧化劑在水產品中使用[4]。張曉麗等[5]研究表明竹葉抗氧化物對鮮羅非魚片具有良好的抗菌和抗氧化作用。殼聚糖（chitosan）又稱脫乙酰甲殼素，是甲殼素經化學處理脫乙酰基后的產物，是惟一的堿性天然多糖，在自然界中含量豐富，無毒安全，在各個領域都有廣泛的應用[6]。因殼聚糖分子中帶有游離氨基，在酸性溶液中易成鹽，呈陽離子性質。能抑制一些真菌、細菌和病毒的生長繁殖。周強等[7]研究表明，殼聚糖復合膜組能有效保持魚肉的感官品質，防止草魚肉營養價值及鮮度的下降。陳軍等[8]研究發現冰溫結合殼聚糖涂膜處理能有效的提高草魚片的保鮮效果，使草魚片的貨架期由9 d延長至15 d～18 d。

目前國內外將竹葉抗氧化物結合殼聚糖應用到青魚保鮮的研究還未見報道。本文以竹葉抗氧化物和殼聚糖為復合保鮮劑，探究其對青魚在4℃貯藏條件下的品質影響，為延長青魚貨架期提供理論支持和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮青魚：泰州市海陵區農貿市場；PE保鮮袋：泰州市大潤發超市。

竹葉抗氧化物（總黃酮含量≥10%）（食品級）：河南豫中生物科技有限公司；殼聚糖（脫乙酰度≥90%）（食品級）：國藥集團藥業股份有限公司；氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲基紅、亞甲基藍、1-丁醇、2-硫代巴比妥酸（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；平板計數瓊脂培養基生化試劑：青島高科海博生物科技有限公司；標準品腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinix acid，IMP）、次黃嘌呤（inosine，Hx）、次黃嘌呤核苷（inosine，HxR）（純度均＞99%）：美國 Sigma公司。其他常用試劑和藥品均為國產分析純。

1260 Infinity高效液相色譜儀、SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，粒徑 5 μm）：美國 Agilent公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；KDN-04B半自動凱氏定氮儀：上海右一儀器有限公司；G154DW立式壓力蒸汽滅菌鍋：山東省諸城市食品機械有限公司；BGZ-240電熱恒溫干燥箱：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫培養箱：廣州滬瑞明儀器有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

鮮活青魚去除魚頭、魚尾、魚鱗和內臟后，用無菌水洗凈，自然瀝干水分，取其脊背部魚肉切成1 cm～2 cm厚的魚片（約30 g），分別在特定濃度配比的保鮮劑溶液中浸漬5 min，取出瀝干，用無菌食品自封袋分裝并編號，置于4℃環境下貯藏。

1.2.2 復合保鮮劑最佳配比的確定

參考GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》對食品中添加劑的使用量規定[9]（竹葉抗氧化物和殼聚糖在水產品中的最高許可用量分別為0.5 g/kg和6 g/kg），將一定量的竹葉抗氧化物、殼聚糖分別溶解于水和含有1%醋酸的水溶液中，配成不同濃度的單一生物保鮮劑[10]。由預試驗的研究結果可知，竹葉抗氧化物溶液濃度為2 g/L，殼聚糖濃度為15 g/L保鮮效果較好。因此本試驗采用竹葉抗氧化物、殼聚糖的取值水平分別為1 g/L～3 g/L和10 g/L～20 g/L，將不添加任何保鮮劑的0.5%醋酸溶液處理組作為空白對照組，試驗設計如表1所示。

表1 試驗設計表Table 1 Design for experimentation

按照表1的不同處理組處理青魚片后，于4℃環境下貯藏5 d后進行揮發性鹽基氮含量檢測，確定最佳的復合保鮮劑配比。

1.2.3 復合保鮮劑對草魚片貯藏品質的影響

選擇最佳配比濃度的復合液處理魚體作為試驗組，不經復合液處理的魚體作為空白對照組，對其在4℃貯藏溫度下進行綜合感官評定，并測定其揮發性鹽基氮含量（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid，TBA值）、K值和菌落總數的變化，每隔2 d測定魚體1次。

1.2.4 鮮度指標檢測方法

1.2.4.1 綜合感官評定

依據GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》[11]，感官評定由受專門培訓的感官評定小組6人（3男3女），對各處理組青魚片的色澤、氣味、狀態等進行綜合評分，最后取其綜合評分值[12]，具體評分標準見表2。色澤、氣味、狀態權重分別為0.3、0.4、0.3，計算加權平均分。最高分為5分，最低分為1分，3分以下評定為不合格，已不新鮮，不再適合食用。

表2 青魚片感官評分標準表Table 2 The sensory evaluation standard table of black carp fillet

續表2 青魚片感官評分標準表Continue table 2 The sensory evaluation standard table of black carp fillet

1.2.4.2 揮發性鹽基氮含量測定

參照GB5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》中的自動凱氏定氮儀法[12]。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBA）測定

參照GB/T35252-2017《動植物油脂2-硫代巴比妥酸值的測定直接法》[13]。

稱取2 g（m）魚肉糜，轉移至25 mL容量瓶中，用1-丁醇溶解并稀釋至刻度，吸取5 mL樣品液加入具塞試管中，加入5 mLTBA試劑，充分混勻。將具塞試管置于95℃水浴鍋中加熱2 h，冷卻至室溫（25℃）。將具塞試管中的溶液轉移到干凈、干燥的10 mm比色皿中，用蒸餾水在530 nm處校正分光光度計零點，測定溶液吸光度（A）同時做試劑空白，測定試劑空白吸光度（B）。TBA值按以下公式計算。

式中：A為被測溶液的吸光度；B為空白試劑的吸光度；m為樣品的質量，mg；50為試樣用1-丁醇稀釋至25 mL并用10 mm比色皿測定吸光度的有效因子。

1.2.4.4 K值的測定

參照SC/T 3048-2014《魚類鮮度指標K值的測定高效液相色譜法》[14]。稱取均質后的魚肉樣品（2.00±0.02）g放入離心管內，加入10%的高氯酸溶液20 mL，渦旋振蕩1 min，在4℃下8 000 r/min離心10 min，取出上清液，再用5%高氯酸溶液10 mL提取沉淀物中的待測物，在4℃下8 000 r/min離心10 min。重復操作1次，合并上清液。用10 mol/L的NaOH溶液調提取液pH值近6.0，然后再用1 mol/L的NaOH溶液繼續調節pH值至6.0～6.4。將已調好pH值后的溶液移至經預冷的容量瓶中，用4℃蒸餾水定容至50 mL。在4℃下8 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液于4℃下保存，待測。

K值計算公式：

式中：MHxR為次黃嘌呤核苷含量，μmol/g；MHx為次黃嘌呤含量，μmol/g；MATP為三磷酸腺苷含量，μmol/g；MADP為二磷酸腺苷含量，μmol/g；MAMP為腺苷酸含量，μmol/g；MIMP為肌苷酸含量，μmol/g。

1.2.4.5 菌落總數測定

參照GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》中的平板計數法進行測定[15]。

稱取25 g碎青魚肉置盛有225 mL生理鹽水的無菌均質杯內，8 000 r/min～10 000 r/min均質 1 min～2 min，制成料液比為1∶10（g/mL）的樣品勻液。并依次進行10倍遞增稀釋處理，最終在1∶100和1∶1000稀釋液中取1 mL涂布在培養基表面，（30±1）℃培養（72±3）h，每個稀釋梯度最少做2個平行。

2 結果與分析

2.1 復合保鮮劑最佳配比的確定

青魚片經茶多酚和殼聚糖復合液處理后，在4℃環境下貯藏5 d后的TVB-N含量，如圖1所示。

圖1 青魚片經不同比例復合保鮮劑處理5 d后的TVB-N值Fig.1 TVB-N Value of black carp fillet treated with different proportions of compound preservative for 5 days

由圖1可知，青魚片分別經9組A2至A10不同比例復合保鮮劑處理后，TVB-N值均顯著低于空白對照組A1組，其中，A9組TVB-N值最低，說明3g/L竹葉抗氧化物與15 g/L殼聚糖組成的復合保鮮劑保鮮效果最好，因此，選擇3 g/L竹葉抗氧化物與15 g/L殼聚糖作為最佳復合保鮮劑進行后續對青魚片貯藏品質的研究。

2.2 復合保鮮劑處理對青魚片貯藏品質的影響

2.2.1 復合保鮮劑對青魚片在貯藏中感官品質的影響

魚肉中脂肪氧化酸敗產生丙二醛等物質，蛋白質在酶及微生物作用分解產生氨、三甲胺、硫化氫等物質，這些物質均會使魚體產生腐敗性的刺鼻氣味。微生物代謝產物及脂肪氧化導致的色素分解會使魚肉色澤發生變化；由于蛋白質的分解使得魚肉組織結構受到破壞致使魚肉組織松散、無彈性，組織狀態發生變化[16]。青魚貯藏期間感官評分的變化如圖2所示。

圖2 青魚片貯藏過程中感官評分的變化Fig.2 Changes of sensory score in the storage of black carp fillets

由圖2可知，貯藏期間復合保鮮劑組和空白對照組的感官評分值均隨著時間的延長而下降。空白對照組感官評分值下降趨勢較復合保鮮劑組顯著，在第8天時感官評分值僅為3.08±0.01，而復合保鮮劑組感官評分值在整個貯藏期間下降緩慢，感官評分值均高于空白對照組，在第14天時仍大于3，說明復合保鮮劑能顯著抑制魚肉感官品質下降，使其在較長時間內維持良好的貯藏品質。

2.2.2 復合保鮮劑對青魚片在貯藏中TVB-N含量的影響

揮發性鹽基氮（TVB-N）是指動物性食品中蛋白質由于肌肉內源酶或微生物的作用，分解而產生的氨以及胺類等堿性含氮揮發性物質[17]。TVB-N值通常作為水產品腐敗變質的評定指標。GB2733-2015規定，淡水魚蝦的TVB-N值≤20 mg/100 g[11]。青魚在4℃貯藏過程中的TVB-N含量變化如圖3所示。

圖3 青魚片貯藏過程中TVB-N值的變化Fig.3 Changes of TVB-N value in the storage of black carp fillets

由圖3可知，在4℃貯藏條件下，復合保鮮劑組和空白對照組的TVB-N含量在貯藏初期（0～4 d）差異不顯著。隨著貯藏時間的增加，空白對照組的TVB-N含量急劇上升，而復合保鮮劑組的TVB-N含量上升較緩慢，兩組差異逐漸增大。空白對照組在貯藏8 d時的TVB-N含量已達（20.32±0.02）mg/g，超過了國標規定的20 mg/100 g的上限值。復合保鮮劑組樣品貯藏8d時的 TVB-N 含量為（8.52±0.01）mg/g，8 d后 TVBN值上升較之前稍快，到第14天時，TVB-N含量為（30.38±0.02）mg/g，達到上限值。說明竹葉抗氧化物-殼聚糖復合保鮮劑的添加減緩了TVB-N的生成，可使青魚在4℃貯藏溫度下的貨架期由6 d～8 d延長至12 d～14 d。

2.2.3 復合保鮮劑對青魚片在貯藏中TBA值的影響

TBA是反映脂肪氧化程度的重要指標，廣泛應用于測定肉類、水產品等產品的脂肪氧化酸敗程度。TBA值越大，說明脂肪氧化腐敗程度越高，魚肉的腐敗程度越高，魚肉的品質越低。青魚在貯藏期間TBA值變化如圖4所示。

圖4 青魚片貯藏過程中TBA值的變化Fig.4 Changes of TBA value in the storage of black carp fillets

由圖4可知，隨著時間的延長復合保鮮劑組和空白對照組的TBA值均逐漸增大，呈不斷上升趨勢。復合保鮮劑組在整個貯藏期間的TBA值均顯著低于空白對照組，在貯藏第10天時，空白對照組的TBA值達到了0.138±0.004，而復合保鮮劑組的TBA值變化幅度不大，從初始的0.018±0.001才上升至0.082±0.002。表明竹葉抗氧化物和殼聚糖復合保鮮液能明顯抑制不飽和脂肪酸的氧化分解，減少丙二醛的生成，從而延緩青魚片的貨架期。

2.2.4 復合保鮮劑對青魚片在貯藏中K值的影響

K值是評價水產品質量的一個重要鮮度指標，反映了水產品初期三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）的降解程度。一般來講，鮮殺魚的K值通常低于10%，K值在20%以下為一級鮮度，可作為生食魚肉，K值在20%～40%為二級鮮度，K值在60%～80%為初期腐敗。青魚在貯藏期間K值變化如圖5所示。

圖5 青魚片貯藏過程中K值的變化Fig.5 Changes of K value in the storage of black carp fillets

由圖5可知，空白對照組K值增長速率較快，貯藏至6 d時為（45.87±0.01）%，超過了二級鮮度，貯藏至8 d時為（60.32±0.02）%，已開始腐敗變質。復合保鮮劑組貯藏10 d時K值為（35.88±0.01）%，仍在二級鮮度范圍，貯藏14 d時為（59.32±0.02）%，接近腐敗變質的上限，說明竹葉抗氧化物和殼聚糖復合保鮮液能有效抑制微生物的生長繁殖，抑制魚肉中的核苷酸酶的活性，從而減少AMP的降解，表現出較好的貯藏效果。

2.2.5 復合保鮮劑對青魚片在貯藏中菌落總數的影響

魚肉的腐敗與細菌的生長繁殖密切相關，魚肉中菌落總數是反映魚類腐敗程度的重要指標。圖6為青魚在貯藏過程中的菌落總數變化[18-19]。

圖6 青魚片貯藏過程中菌落總數的變化Fig.6 Changes of colony count in the storage of black carp fillets

由圖6可知，空白對照組與復合保鮮劑組魚肉樣品的菌落總數均隨著貯藏時間的延長而逐漸增加。在整個10 d的貯藏期內，空白對照組菌落總數均高于復合保鮮劑組。空白對照組在貯藏第8天時，菌落總數對數已達（6.25±0.01）CFU/g，超過了規定的可食用限量標準6 CFU/g；而復合保鮮劑組青魚的菌落總數增長速率明顯減慢，貯藏至第14天時菌落總數對數為（6.08±0.01）CFU/g，剛超過限量標準值。由此可知，4℃貯藏條件下，復合保鮮劑組處理組可使青魚片貨架期由6 d～8 d延長至12 d～14 d。竹葉抗氧化物和殼聚糖復合保鮮劑殺菌機理可能是其具有協同抑菌作用，可使細菌細胞膜蛋白質發生變性而起到了殺菌作用[20-21]。

3 結論

本文以青魚片為研究對象，探究了在4℃低溫貯藏條件下，竹葉抗氧化物與殼聚糖復合保鮮劑對青魚片貯藏品質的影響。結果表明：竹葉抗氧化物與殼聚糖復合保鮮劑具有較好的保鮮效果，3 g/L竹葉抗氧化物與15 g/L殼聚糖為最佳配比。在經最佳復合保鮮劑處理后，其菌落總數、TVB-N、TBA、K值均明顯低于未經保鮮劑處理的對照組，而感官評分高于對照組，貨架期可由6 d～8 d延長至12 d～14 d。本研究對青魚品質控制、保鮮加工具有一定的參考價值。