香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)野生釀酒酵母的分離鑒定和發(fā)酵性能研究

楊寬，張帥，王柱華，王慧玲，王佩，毛如志，王文鵬，何霞紅，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明650201）

葡萄酒是一種營養(yǎng)豐富的低酒精度發(fā)酵飲料，是用新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)過酵母發(fā)酵、陳釀而成，由于其具有誘人的“色香味”以及很強的國際認同感，受到了越來越多人的關注和喜愛[1-2]。葡萄酒的釀造主要是在釀酒酵母的作用下，采用自然發(fā)酵或純種發(fā)酵，將葡萄原料中的優(yōu)良品質(zhì)在酒中充分表現(xiàn)出來[3]。釀酒酵母的發(fā)酵特性因菌株不同而存在明顯差異，對底物的利用和發(fā)酵產(chǎn)物也不同，從而使葡萄酒的風味物質(zhì)存在差異，賦予產(chǎn)品獨特的風味[4-5]。因此，酵母菌株的品質(zhì)和特性對葡萄酒的質(zhì)量影響很大，直接影響到葡萄酒的口感和風味，對葡萄酒特色和風格的形成至關重要[6]。現(xiàn)已知的葡萄酒香氣成分超過1000種，其中由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分超過400種[7]。釀酒酵母作為當?shù)亍帮L土terroir”的一部分，是充分體現(xiàn)當?shù)仄咸丫铺厣谋匾獥l件。我國葡萄種植面積廣，不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境差異大，但隨著種植面積逐年擴大，葡萄酒產(chǎn)量逐年上升，為保證發(fā)酵速率和發(fā)酵產(chǎn)品的一致性并避免污染，大多數(shù)國內(nèi)葡萄酒生產(chǎn)商傾向于使用進口活性干酵母，這在一定程度上減少了當?shù)匾吧湍笇ζ咸丫葡銡獾呢暙I，從而導致我國葡萄酒品質(zhì)單一化、同質(zhì)化嚴重等問題。研究表明，許多著名葡萄酒都是當?shù)仄咸选⒐に嚰夹g和微生物菌群共同作用的產(chǎn)物，形成獨具特色的產(chǎn)地酒[8]。

關于釀酒酵母對于葡萄酒風味的影響，國內(nèi)外的很多專家已經(jīng)做了大量的研究。程仕偉等對煙臺貴人香自然發(fā)酵醪中的野生釀酒酵母進行了選育及發(fā)酵特性的研究，發(fā)現(xiàn)菌株YGF2釀造的葡萄酒質(zhì)量較好，香氣濃郁，部分指標優(yōu)于商品釀酒酵母，具備生產(chǎn)區(qū)域特色葡萄酒的潛力[9]。李金鵬對寧夏賀蘭山東麓釀酒酵母進行了分離鑒定和發(fā)酵性能研究，結(jié)果在野生釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物中檢出了14種商業(yè)釀酒酵母沒有檢出的物質(zhì)[10]。劉峻溪等探究了野生酵母和商品酵母在發(fā)酵葡萄酒中的揮發(fā)性成分差異，結(jié)果表明野生釀酒酵母所釀造的葡萄酒中主要揮發(fā)性物質(zhì)的總含量要高于商品釀酒酵母[11]。Parapouli等從當?shù)仄咸哑贩N自然發(fā)酵過程中篩選出野生酵母，通過和商用酵母進行對比，結(jié)果表明用野生酵母所釀的酒風味更加豐富多樣[12]。Carrascosa等研究了用野生酵母菌發(fā)酵西班牙白色葡萄品種Albari?o，結(jié)果表明用當?shù)胤蛛x的酵母菌可以調(diào)節(jié)Albari?o白葡萄酒的感官特性[13]。Knight等研究發(fā)現(xiàn)分離自不同地區(qū)的釀酒酵母對葡萄酒香氣質(zhì)量的影響具有獨特的地理特征，香氣物質(zhì)會隨著不同的酵母地理來源而出現(xiàn)變化[14]。Vilanova等的研究表明通過篩選當?shù)氐囊吧湍妇梢苑e極的影響葡萄酒的最終質(zhì)量，他還進一步證明了，通過自然發(fā)酵得到的葡萄酒比接種選定的酵母菌株可以獲得更多的芳香物質(zhì)[15-16]。

香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)的葡萄園主要建在金沙江和瀾滄江流域海拔1 700 m～2 800 m的干熱和干冷河谷地帶，是目前世界上海拔最高的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)之一[17]。香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄種植面積已超2萬畝，并且坐落著著名的酒企，如酩悅軒尼詩香格里拉酒業(yè)，香格里拉酒業(yè)，梅里酒莊等。香格里拉地質(zhì)地貌和氣候多樣性非常豐富，蘊含著大量的微生物資源。商敬敏[18]對香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)德欽地區(qū)葡萄園土壤中的酵母菌進行了分離鑒定和耐受性分析，共分離到8屬8種，但并未分離到釀酒酵母；史濤濤[19]研究了德欽冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化，并對冰葡萄分離出的釀酒酵母發(fā)酵特性進行了檢測。趙悅等[20]對香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)的非釀酒酵母進行了分離鑒定及發(fā)酵香氣分析。而本研究擬從香格里拉葡萄園中采集自然成熟的赤霞珠葡萄，對這些葡萄進行人工破碎后自然發(fā)酵，從自然發(fā)酵的葡萄醪中分離篩選釀酒酵母，通過對分離釀酒酵母的耐受性、發(fā)酵特性進行分析，并以商業(yè)酵母為對照，以期能夠篩選到耐受性強，發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母，進而運用到香格里拉酒企的實際釀酒生產(chǎn)當中，增加香格里拉葡萄酒的產(chǎn)區(qū)特色。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株分離材料

從香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)金沙江和瀾滄江河谷流域選取5個5年以上的葡萄園，運用五點取樣法，每個園子采集10 kg的葡萄樣品，人工搗碎放在10 L的廣口玻璃瓶中進行自然發(fā)酵。其中采樣點斯農(nóng)（SN）、江坡（JP）和阿東（AD）屬于瀾滄江流域，東水（DS）和東旺（DW）屬于金沙江流域，從成熟葡萄自然發(fā)酵過程中分離野生酵母菌株。商業(yè)酵母UV43（加拿大Lallemand公司）、F15（法國laffort公司）：香格里拉酒業(yè)股份有限公司提供。香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)采樣點信息見表1。

表1 香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)采樣點信息Table 1 Information on the sampling point of Shangri-La wineproducing region

1.1.2 常用培養(yǎng)基

研究中主要使用以下培養(yǎng)基類型，配制完成后高壓101℃滅菌30 min備用。

YEPD（yeast extract peptone dextrose）培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，為了防止細菌污染添加100 mg/L的氯霉素。

WL（wallerstein laboratory）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[21]：酵母浸粉4.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖50.0 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，溴甲酚綠 22 mg/L，瓊脂 20.0 g/L，pH 5.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，為了防止細菌污染添加100 mg/L的氯霉素。

模擬酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，葡萄糖 200.0 g/L。

1.1.3 主要試劑及配方

酵母基因組提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；酵母26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴增（Master Mix、DNA Marker、ddH2O、瓊脂糖、TAE 電泳緩沖液）：北京擎科生物科技有限公司；引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAA AAG-3′）、NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）：由北京擎科生物科技有限公司合成；斐林試劑、NaOH標準滴定溶液、鎢酸鈉、鉬酸鈉、單寧酸、硫酸鋰、溴水、沒食子酸、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉和鄰苯二甲酸氫鉀：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

人工氣候箱（MGC-300H）、電熱鼓風干燥箱（PH-030A）：上海一恒科學儀器有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F280）：常州申光儀器有限公司；超凈工作臺（BCM-1600A）：蘇州安泰空氣技術有限公司；光學顯微鏡（CX41）：奧林巴斯（中國）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH.S21-8）：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電子天平（CP214）、pH 計（ST5000-B）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；紫外-可見光分光光度計（UV-3150）：日本島津公司；高壓滅菌鍋（GI54DW）：致微（廈門）儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)儀（Quantum ST4）：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增儀（6311000070）：Eppendorf。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離

自然發(fā)酵過程中酵母菌的分離：將采集的成熟葡萄樣品，人工除梗破碎后放入10 L的玻璃罐中進行自然發(fā)酵，用WineScan FT 2-FOSS葡萄酒成分快速分析儀監(jiān)測發(fā)酵過程，分別在發(fā)酵的前、中、后期取發(fā)酵液0.1 mL，加入0.9 mL無菌水中進行梯度稀釋至10-5或10-6，取0.1 mL稀釋后的發(fā)酵液放入YEPD固體培養(yǎng)基，以無菌涂布器涂勻，28℃培養(yǎng)2 d～3 d，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)差異，在每個發(fā)酵時期分別選取10個～15個菌落進行劃線純化，多次純化后放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酵母菌的鑒定

1.3.2.1 酵母菌的初步形態(tài)學分類

將分離純化到的酵母菌用劃線法接種到WL培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d后，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)初步鑒定酵母的種屬，并對形態(tài)相似的菌株進行歸類。基于WL的培養(yǎng)結(jié)果，再在每種培養(yǎng)類型中選取1株～2株進行26S rDNA D1/D2區(qū)序列分子鑒定。

1.3.2.2 酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分子鑒定

首先提取酵母基因組DNA，然后用PCR擴增26S rDNA D1/D2區(qū)序列，PCR反應采用50 μL體系，其中雙鏈總DNA模板各2 μL，上下游引物各2 μL，Master Mix 25 μL，最后添加 ddH2O 定容至 50 μL，PCR 產(chǎn)物送至北京擎科生物技術有限公司進行測序，然后將測序結(jié)果放在NCBI上進行BLAST search，比較供試菌株與Genbank中相應菌株的相似性，根據(jù)Kuttzman等[22]的酵母菌分類標準，同種內(nèi)不同菌株間D1/D2區(qū)序列差異不超過1%，則它們應屬于同一個種，再結(jié)合前面的菌落形態(tài)分析，初步確定酵母菌的種屬。

1.3.3 酵母菌的發(fā)酵力測試

運用杜氏管發(fā)酵法，取100 mLYEPD液體培養(yǎng)基分裝到15 mm×150 mm試管中，倒置放入杜氏管（保證杜氏管中無氣泡），121℃滅菌20 min后備用。將冷卻至常溫的試管中接種酵母菌，放入28℃的人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔4 h觀察杜氏管中氣體的積存量并記錄下來，連續(xù)觀察7 d，最終根據(jù)酵母的產(chǎn)氣情況，凝聚性和發(fā)酵液的氣味來對酵母菌進行初步篩選。

1.3.4 釀酒酵母的抗性評價

1.3.4.1 葡萄糖耐受性評價

分別配置不同葡萄糖質(zhì)量濃度（30%、40%、50%、60%），不同 NaCl質(zhì)量濃度（6%、8%、10%、12%、14%、16%），不同乙醇體積分數(shù)（10%、12%、14%、16%）的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取10 mL分裝到15 mm×150 mm試管中，倒置放入杜氏管，保證杜氏管中無氣泡。接種活化的供試菌株到試管中，28℃靜置培養(yǎng)，每隔4 h觀察一次杜氏管內(nèi)的氣體寄存量并做好記錄[20]。

1.3.4.2 高溫耐受性評價

取滅過菌的YEPD液體培養(yǎng)基1mL分裝到1.5mL的無菌離心管中。接種酵母菌到離心管中，分別置于35、40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴鍋中溫育 4 h，取出后再在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，最后取100 μL用涂布器涂布于YEPD培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2 d～3 d，觀察記錄菌落生長情況。

1.3.5 模擬酒精發(fā)酵試驗

配置200 g/L的YEPD液體培養(yǎng)基作為模擬酒精發(fā)酵液，取100 mL培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min后備用。然后將活化的待測菌株接種到三角瓶中，立即稱重1次，28℃，120 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24 h稱重一次，參照國標GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定發(fā)酵液的理化指標。

1.3.6 葡萄酒發(fā)酵試驗

從香格里拉葡萄園中采摘赤霞珠葡萄運抵實驗室后，立即進行破碎，將破碎后的發(fā)酵醪裝入10 L的發(fā)酵玻璃瓶中，裝量約為80%，并按照60 mg/L的量加入二氧化硫，浸漬24 h后接種待測酵母菌，酵母菌的接種量約為106個活酵母細胞/mL。然后進行酒精發(fā)酵，在發(fā)酵期間每天進行壓帽2次～3次，待還原糖降為4 g/L時，視為發(fā)酵結(jié)束，后浸漬36 h后分離皮渣，最后靜置澄清1個月后，分離酒泥，得到葡萄原酒。

1.3.7 葡萄酒的常規(guī)理化性質(zhì)測定

還原糖：斐林試劑法；酒精度：密度瓶法；干浸出物：密度瓶法；總酸：氫氧化鈉溶液滴定法（以酒石酸計）；揮發(fā)酸：水蒸氣蒸餾滴定法（以乙酸計）。以上指標均按照國標GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

1.3.8 色度、色調(diào)的測定

采用可見-紫外分光光度計測定波長在420、520、620 nm條件下的吸光值。色度值記為三者之和，即色度=A420+A520+A620；色調(diào)以420 nm與520 nm下吸光值的比值計算，即色調(diào)=A420/A520。

1.3.9 單寧、總酚含量的測定

單寧：采用福林-丹尼斯法（Folin-Denis）；總酚：采用福林-肖卡法（Folin-Ciocalteu）。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

本研究試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行計算，用SPSS 18.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生釀酒酵母的分離和鑒定

初步鑒定為釀酒酵母的菌落和細胞形態(tài)以及PCR擴增條帶見圖1。

圖1 初步鑒定為釀酒酵母的菌落和細胞形態(tài)以及PCR擴增條帶Fig.1 Initially identified as S.cerevisiae colony and cell morphology and PCR amplified bands

從香格里拉5個葡萄園中的葡萄皮上和自然發(fā)酵過程中共分離到230株酵母菌。全部接種到WL培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后，根據(jù)菌落顏色和形態(tài)進行聚類，菌落特征為奶油色帶綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀的可以初步判斷為釀酒酵母（如圖1a）。

其中有98個菌株聚為此類，為了進一步確定WL培養(yǎng)基鑒定的準確性，在聚類為釀酒酵母的類別中隨機選擇2個菌株進行分子鑒定，對菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進行測序，在NCBI上進行BLAST。根據(jù)Kurtzman和Robnett的酵母菌分類標準，同種內(nèi)不同菌株間D1/D2區(qū)序列相似率大于99%，一般可認為是同一個種，隨機挑選的兩個菌株（AD3-1，SN1-9）的序列比對結(jié)果見表2。

表2 2株代表菌株的分子鑒定結(jié)果Table 2 Molecular identification of two representative strains

可以看出兩個菌株和釀酒酵母的相似率為99%，可以鑒定為釀酒酵母，且兩個菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列已經(jīng)上傳至NCBI，獲得了基因庫登錄號（AD3-1：MF769586，SN1-9：MF769605）。

2.2 釀酒酵母的杜氏管發(fā)酵試驗

采用杜氏管法對香格里拉葡萄園自然發(fā)酵過程中分離得到的98株酵母菌進行初步發(fā)酵力的測定，從中篩選出16株起發(fā)早、發(fā)酵快、產(chǎn)香好的菌株，其發(fā)酵力測定結(jié)果見表3。

表3 16株釀酒酵母的杜氏管發(fā)酵力比較Table 3 Comparison of fermentation capacity of 16 strains of Saccharomyces cerevisiae in Durham tube

從表3中可以看出，所選的16株釀酒酵母最晚起發(fā)時間為5 h，一般為4 h就可以啟動發(fā)酵，在起發(fā)時間后的2 h～4 h后，所有菌株產(chǎn)氣均充滿杜氏管，且發(fā)酵液呈現(xiàn)不同的香味，無不愉快的氣味。相對于其他82株釀酒酵母，所篩選的16株釀酒酵母起發(fā)早、發(fā)酵速度快、產(chǎn)香好，可用于進一步的評價篩選。

2.3 16個菌株的綜合抗性比較

對篩選出16株起酵快，發(fā)酵力強的釀酒酵母菌株，通過葡萄糖耐受性、NaCl耐受性、酒精耐受性、高溫耐受性等指標進行綜合評價，見表4。

表4 16株釀酒酵母的綜合抗性評價Table 4 Comprehensive tolerance evaluation of 16 strains of Saccharomyces cerevisiae

從表4可以看出，16株酵母菌都能耐受400 g/L葡萄糖，12%vol的酒精，12%的NaCl濃度，且能正常產(chǎn)氣發(fā)酵，生長繁殖不受影響，這完全可以滿足一般葡萄酒的生產(chǎn)要求。

16株酵母菌株的耐受特性不同，某些菌株只能在1個～2個耐受性方面表現(xiàn)出色，而很少有在各個方面都很強的菌株，綜合杜氏管發(fā)酵數(shù)據(jù)和耐受性數(shù)據(jù)，最終選出 DW4-3、DS3-8、DS2-5、DS3-6、JP2-3 等5 株抗性相對較強的菌株做下一步的模擬酒精發(fā)酵試驗。

2.4 5個酵母菌株的模擬酒精發(fā)酵試驗

對以上選出的5株釀酒酵母做模擬酒精發(fā)酵試驗，并與2株商業(yè)酵母F15和UV43做對比，分別比較它們的發(fā)酵力，產(chǎn)酸、酒精和殘?zhí)堑臄?shù)據(jù)。7株釀酒酵母的模擬酒精發(fā)酵試驗見表5。

表5 7株釀酒酵母的模擬酒精發(fā)酵試驗Table 5 Comprehensive tolerance evaluation of 7 strains of Saccharomyces cerevisiae

由表5可以看出各菌株發(fā)酵性能之間差異明顯，但各有優(yōu)劣，其中野生酵母DS3-6的發(fā)酵力最強，菌株DW4-3、DS2-5的發(fā)酵力均比兩株商業(yè)酵母的強，且具有顯著差異，而商業(yè)酵母UV43相對較弱；針對產(chǎn)酒精能力，菌株DS3-8最強，其次是商業(yè)酵母UV43和F15；對于揮發(fā)酸和總酸來說，菌株DS3-8也較高；整體而言，自選酵母的不同菌株在發(fā)酵過程中表現(xiàn)各不同，各有優(yōu)缺點，商業(yè)菌株UV43和F15發(fā)酵性能表現(xiàn)較穩(wěn)定，其他5株野生酵母發(fā)酵力較好。

2.5 葡萄酒發(fā)酵試驗

以香格里拉產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄為原料，按照干紅葡萄酒釀造工藝接種篩選的5株酵母DW4-3、DS3-8、DS2-5、DS3-6、JP2-3進行發(fā)酵，并與商業(yè)酵母 F15作對比發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，對每個葡萄原酒酒樣進行理化指標檢測，包括總糖、酒精度、總酸、揮發(fā)酸、干浸出物質(zhì)、單寧、總酚和色度色調(diào)。所選釀酒酵母菌株釀造干紅葡萄酒的理化性質(zhì)分析見表6。

根據(jù)表6的結(jié)果，所有菌株發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，所得酒樣總糖含量均在4 g/L以下，達到干紅葡萄酒關于總糖含量的標準。酒精度除了CK外，均在14%vol左右，相對于商業(yè)酵母，除了菌株DS2-5，其它菌株酒精度均比F15高，且差異顯著（p<0.05）。所有菌株的總酸含量在5.76 g/L～7.78 g/L之間，其中CK的最高，其次是菌株JP2-3，野生釀酒酵母和商業(yè)酵母無顯著差異。關于揮發(fā)酸，除了菌株DW4-3和DS3-6在國家規(guī)定范圍內(nèi)之內(nèi)[23]，其他菌株釀造干紅葡萄酒的揮發(fā)酸普遍較高，其中菌株JP2-3甚至接近2 g/L，商業(yè)酵母也較高，其中菌株DS2-5和商業(yè)酵母揮發(fā)酸含量無顯著差異，推測可能在葡萄酒存放過程中由于醋酸菌感染造成揮發(fā)酸升高。葡萄酒的干浸出物是葡萄酒的一個很重要的理化指標，也是一個衡量葡萄酒質(zhì)量的重要指標，它和葡萄品種，葡萄原料的質(zhì)量以及釀酒工藝都有很大的關系，除了這些，干浸出物中還含有一些酵母酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，所以這和酵母菌株也有很大的關系。研究結(jié)果表明，干浸出物含量最高的是DS 2-5，含量為28.75 g/L，菌株DS3-8含量最低，其余3株自選酵母所釀干紅葡萄酒和商業(yè)酵母均無顯著差異。各菌株所釀葡萄酒單寧、總酚、色度和色調(diào)的情況見表7。

表6 所選釀酒酵母菌株釀造干紅葡萄酒的理化性質(zhì)分析Table 6 Physicochemical properties of dry red wine brewed by selected strains

表7 所選釀酒菌株釀造干紅葡萄酒的理化性質(zhì)分析Table 7 Physicochemical properties of dry red wine brewed by selected strains

一般來說，葡萄酒的總酚含量和色度呈正相關性，因為葡萄酒中的顯色物質(zhì)多為酚類物質(zhì)，從所測結(jié)果來看，菌株DS2-5所得總酚含量最高，其次是商業(yè)酵母，并具有顯著差異。葡萄酒的發(fā)酵過程，同時是葡萄果實中的酚類物質(zhì)、單寧和香氣的浸漬提取過程，提取效果的好壞，和發(fā)酵過程的溫度、pH值和操作工藝有關，同時酵母菌的活動也會影響這個過程[24]。單寧的含量可以影響葡萄酒的酒體結(jié)構(gòu)和口感質(zhì)地，除了CK，商業(yè)酵母所釀酒的單寧含量最高，其次是DS2-5和JP2-3，CK的含量最高，推測在葡萄原料相同的情況下，自然發(fā)酵過程中釀酒酵母的混合菌株發(fā)酵可能更有助于單寧的浸漬提取，這有待下一步的驗證。相對于商業(yè)酵母，除了菌株JP2-3，野生自選菌株的色調(diào)和商業(yè)酵母均無顯著性差異。綜合不同菌株所釀葡萄酒的理化性質(zhì)指標，菌株DS2-5所釀干紅葡萄酒總糖、酒精度和總酸均符合干紅葡萄酒國家標準，且在干浸出物，總酚和單寧含量等方面表現(xiàn)突出，干浸出物和總酚含量高于商業(yè)酵母F15，色調(diào)和商業(yè)酵母無顯著性差異，可以作為優(yōu)選酵母菌做下一步的釀酒試驗以及用于實際釀酒生產(chǎn)當中。

3 討論與結(jié)論

本研究一共在香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離到98株釀酒酵母，首先對這些菌株進行杜氏管發(fā)酵試驗初步篩選出起發(fā)早，產(chǎn)香好的菌株，然后對這些菌株進行耐糖、耐酒精、耐氯化鈉以及耐高溫等進行抗性評價，最終選出 DW4-3、DS3-8、DS2-5、DS3-6、JP2-3 等 5株表現(xiàn)較好的菌株做下一步的葡萄酒發(fā)酵試驗。經(jīng)過模擬酒精發(fā)酵以及干紅葡萄酒小試，綜合不同菌株所釀葡萄酒的理化性質(zhì)指標，菌株DS2-5所釀干紅葡萄酒總糖、酒精度和總酸均符合干紅葡萄酒國際規(guī)定，且在干浸出物，總酚和單寧含量等方面表現(xiàn)突出，干浸出物和總酚含量高于商業(yè)酵母F15，色調(diào)和商業(yè)酵母無顯著性差異，可以作為優(yōu)選酵母菌做下一步的釀酒試驗以及用于實際的釀酒生產(chǎn)當中。

釀酒酵母在發(fā)酵葡萄酒的過程當中，會遇到各種不利條件，如高溫，低溫，高滲透壓以及高酒精度等，如果釀酒酵母菌株抗脅迫能力不強，就會有發(fā)酵遲滯和發(fā)酵停止的風險[25]。而在其他外界條件適宜的情況下，酵母耐葡萄糖能力越強，其生長和發(fā)酵速率受影響越小，產(chǎn)酒度越高，耐高溫菌株可以間接降低葡萄酒的生產(chǎn)成本[18]。所以對釀酒酵母菌株進行耐受性檢驗，是進行工業(yè)生產(chǎn)的基礎。王風梅等[26]探究了內(nèi)蒙古西部地區(qū)葡萄酒釀酒酵母的發(fā)酵特性，從菌株的耐受性和發(fā)酵特性展開研究，篩選到了可以耐受18%vol酒精度和14%NaCl濃度的釀酒酵母，而本研究分離的菌株最大酒精耐受度為16%vol，最大NaCl濃度為12%，高糖耐受性相同，推測釀酒酵母在不同地理氣候環(huán)境下具有產(chǎn)區(qū)差異，但都可以滿足正常的葡萄酒發(fā)酵過程。程仕偉等[27]對新疆霞多麗葡萄自然發(fā)酵醪中的釀酒酵母進行了選育及釀造特性研究，結(jié)合發(fā)酵特性、耐受性分析以及釀酒試驗，最終選出一株（XXF3）可以耐受500 g/L葡萄糖，19%vol酒精的釀酒酵母，其整體發(fā)酵指標較好，部分指標優(yōu)于商業(yè)酵母，和本研究的結(jié)果類似。張莉等[28]在蘋果園土壤、果實及表皮中的釀酒酵母菌株進行了耐受性分析，篩選到菌株Y-2和F-3在400 g/L葡萄糖下能夠快速啟動發(fā)酵，同時能夠耐受16%vol酒精、20 g/L的檸檬酸和200 mg/L的SO2。綜合以上分析，在不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)或者不同地域都可以分離到大量的釀酒酵母，不同菌株間耐受性差異較大，經(jīng)過不同條件篩選，都可以分離出抗逆性較強的菌株，以期用于實際的生產(chǎn)當中。

葡萄酒的理化指標在很大程度可以反映葡萄酒的質(zhì)量，葡萄酒在由葡萄轉(zhuǎn)化為酒的過程當中，酵母菌是其中主要的驅(qū)動力量，釀酒酵母把葡萄汁中的糖分轉(zhuǎn)為為酒精、二氧化碳和其他不同的副產(chǎn)物，同時酵母的活動也會影響葡萄果實酚類物質(zhì)、單寧和香氣的浸漬提取過程[24]。在葡萄原料，發(fā)酵工藝相同的情況下，釀酒酵母同樣影響著葡萄酒的質(zhì)量。本研究中野生酵母菌株和商業(yè)酵母菌株F15所釀葡萄酒相比，殘?zhí)蔷? g以下，除了菌株DS2-5，其它菌株酒精度均高于F15，且差異顯著；總酸無顯著差異；干浸出物菌株DS2-5高于F15，且具有顯著差異；單寧含量F15高于野生酵母；總酚含量菌株DS2-5高于F15，且差異顯著。解衛(wèi)海等[29]研究了玫瑰香葡萄自然發(fā)酵醪中選育的釀酒酵母的釀造特性，用篩選的釀酒酵母發(fā)酵赤霞珠葡萄酒，結(jié)果表明野生酵母菌株MF1的發(fā)酵酒樣在常規(guī)參數(shù)上與對照組無明顯差異，在總酚和單寧含量均高于商業(yè)酵母D254和RC212，和本研究結(jié)果相似。蔣文鴻等[30]對昌黎赤霞珠葡萄相關釀酒酵母進行了分離與篩選，發(fā)現(xiàn)野生分離菌株a和d所釀葡萄酒干浸出物和總酚含量均高于商業(yè)酵母，和本研究中所分離的菌株DS2-5特性類似。綜上所述，釀酒酵母在一定程度可以影響葡萄酒的理化性質(zhì)，進而影響葡萄酒的質(zhì)量，經(jīng)過前期篩選，可以獲得發(fā)酵性能和商業(yè)酵母無差異的菌株，并且可以發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選野生酵母菌株所釀葡萄酒在單寧、總酚和干浸出物這方面優(yōu)于商業(yè)酵母，推測在酒精發(fā)酵過程當中優(yōu)選野生酵母菌株增加了葡萄皮的浸漬效果。

香格里拉是一個新興的、具有高原特色的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，該地區(qū)氣候多樣、地理地貌多樣。香格里拉金沙江流域和瀾滄江流域的葡萄園中，蘊藏著豐富的微生物資源，富集了大量的葡萄酒相關酵母，發(fā)掘這些酵母資源為酵母菌多樣性的保護和利用奠定了基礎。釀酒酵母作為葡萄酒發(fā)酵過程當中最重要的一類微生物之一，當?shù)匾吧劸平湍父軌蛲伙@產(chǎn)地葡萄酒的質(zhì)量和風格特色。在本研究中共篩選到5株發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母，下一步要對篩選出的釀酒酵母進行重復小試、中試以及應用到實際生產(chǎn)，以期最終制作成商品菌劑，應用到香格里拉高原特色葡萄酒的生產(chǎn)當中。