沖泡條件對玫瑰茄花青素及總黃酮溶出量的影響

黃曉辰，馬金魁，梁樂欣，馮潤香

（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶526061）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名洛神花，是一種一年或多年生的錦葵科木槿屬植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區的國家，是一種傳統的藥食兩用植物，其莖、葉、花和種子皆可加以利用[1]。嫩葉或莖常用于制作沙拉、酸辣醬或配料[2-3]；種子含豐富的蛋白質，可用于煮湯、榨油或發酵后用于調味[1]；花則被廣泛應用于果凍、果醬、葡萄酒等各種食品及飲料的加工[4-6]。玫瑰茄花萼為杯狀肉質結構[7]，顏色為紫紅色，含豐富的碳水化合物、膳食纖維、蛋白質、維生素、礦物質和多種生物活性物質，如有機酸、植物甾醇、多酚類化合物、花青素、多糖等[1，8]。現代藥理研究表明，玫瑰茄花提取物具有降壓減脂[9-10]、抗菌消炎[11-12]、抗癌[13]、預防貧血[14]、治療鎘中毒[15]等生理作用。

黃酮類化合物廣泛存在于植物體中，是一類次級代謝產物，具有很強的抗氧化作用，可降低心血管疾病的發病率、防癌消炎、調節免疫[16]。玫瑰茄花中含豐富的黃酮類化合物，包括花青素、黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃烷醇和異黃酮，其中花青素是玫瑰茄抗氧化作用的主因[1]。花青素是一類水溶性天然色素，是許多植物體的主要呈色物質，因不同植物中的細胞液酸堿度不同，而呈現不同的顏色[17]。研究表明，玫瑰茄花中的花青素主要是飛燕草素-3-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-桑布雙糖苷、飛燕草素葡萄糖苷和矢車菊素葡萄糖苷[1]。

隨著消費者保健意識的覺醒和大健康時代的到來，花茶成為更多人群的健康選擇。玫瑰茄花茶因其獨特的風味、色澤和天然的保健功能而備受青睞。我國對玫瑰茄的研究起步較晚，現階段，針對玫瑰茄花的研究主要集中于其活性組分提取及藥理作用的探索，而有關日常生活中玫瑰茄花茶的沖泡及其活性成分溶出的研究寥寥無幾。研究沖泡條件對玫瑰茄花青素和黃酮類化合物溶出的影響，將有助于玫瑰茄系列健康食品的研發，提高其資源利用率。本研究利用正交試驗方法優化玫瑰茄花茶的沖泡條件，以期為玫瑰茄花茶的合理沖泡和飲用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄干花萼，無蟲害且無腐爛霉變，產地云南。將玫瑰茄花萼置于45℃干燥過夜，于-18℃密封存儲，待用。

無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉：均為分析純，西隴科學股份有限公司；氯化鉀、鹽酸、三水合乙酸鈉、九水合硝酸鋁：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蘆丁標準品（LE70R58）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

V-1100D可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；DHG-9145A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司；TDL-60B低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

準確稱取一定量的玫瑰茄干花萼樣品于燒杯中，在設定的沖泡時間、沖泡溫度、茶水比參數下，沖泡1次，過濾，待濾液冷卻至室溫（26℃）后，定容，即得玫瑰茄花茶茶湯樣品。

1.3.1 玫瑰茄沖泡條件的單因素試驗

1.3.1.1 影響玫瑰茄花青素溶出量的單因素研究

稱取1 g玫瑰茄樣品，分別固定沖泡溫度70℃、茶水比1∶40（g/mL）、沖泡時間25 min的條件下，研究不同沖泡時間（20、25、30、35、40 min）、不同沖泡溫度（60、70、80、90、100℃）、不同茶水比[1 ∶20、1 ∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]對玫瑰茄茶湯內花青素溶出量的影響。

1.3.1.2 影響玫瑰茄總黃酮溶出量的單因素研究

稱取1 g玫瑰茄樣品，分別固定沖泡溫度70℃、茶水比1∶50（g/mL）、沖泡時間30 min的條件下，研究不同沖泡時間（20、25、30、35、40 min）、不同沖泡溫度（60、70、80、90、100℃）、不同茶水比[1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）]對玫瑰茄茶湯內總黃酮溶出量的影響。

1.3.2 玫瑰茄沖泡條件的正交試驗

依據單因素試驗結果，以沖泡時間、沖泡溫度、茶水比為試驗因素，進行L9（33）正交試驗，研究沖泡時間、沖泡溫度、茶水比對玫瑰茄花茶茶湯內花青素、總黃酮溶出量的影響。花青素溶出的正交試驗因素水平表見表1。

表1 花青素溶出的正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test regarding anthocyanins in roselle tea

總黃酮溶出的正交試驗因素水平表見表2。

表2 總黃酮溶出的正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test regarding flavonoids in roselle tea

1.3.3 玫瑰茄茶湯中花青素溶出量的測定

參考Amaya-Cruz等[18]的方法，略作修改，依據pH示差法的原理測定玫瑰茄茶湯內花青素的含量。稱取一定量的玫瑰茄樣品，用熱水沖泡一定時間后，過濾，移取2 mL濾液于10 mL容量瓶中，分別用pH 1.0、pH 4.5的緩沖溶液定容，在40℃水浴中反應平衡50 min。以蒸餾水作空白對照，分別在520 nm和700 nm處測定花青素的吸光值，選用矢車菊-3-葡萄糖苷作為計量標準，利用Fuleki公式對玫瑰茄茶湯中花青素的溶出量進行計算。

式中：△A為花青素總吸光值；V為提取液總體積，mL；k為稀釋倍數；M為Cy-3-Glu（矢車菊-3-葡萄糖苷）的相對分子質量，449.2 g/mol；ε為Cy-3-Glu的消光系數，26 900 L/（mol·cm）；m為樣品質量，g；L為光程，數值為1 cm。

1.3.4 玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量的測定

標準曲線的繪制：參照范金波等[19]的方法，略作修改。準確稱取蘆丁標準品10 mg，用80%乙醇溶解、定容至50 mL，得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別移取 1、4、8、12、16 mL 蘆丁標準溶液于 50 mL 容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.4 mL，混勻靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.4 mL，混勻后靜置6 min；加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液10 mL，用80%的乙醇定容至50 mL，搖勻，靜置10 min，在波長510 nm處測定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=11.346x-0.006 1（R2=0.999 4）。

玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量測定：取玫瑰茄茶湯5 mL于50 mL容量瓶中，按黃酮標曲繪制方法測定樣品的吸光度，代入回歸方程，得待測茶湯中總黃酮的含量。按下式計算樣品茶湯內總黃酮的溶出量：

式中：C為提取液濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；M為玫瑰茄質量，g。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 沖泡時間對花青素溶出量的影響

沖泡時間對花青素溶出量的影響見圖1。

圖1 沖泡時間對花青素溶出量的影響Fig.1 Effect of brewing time on the release of anthocyanidins

由圖1可知，在一定沖泡時間內（20 min～40 min），玫瑰茄茶湯中花青素溶出量呈先增加后減小的趨勢。當沖泡時間較短時，隨著沖泡時間的延長，花青素溶出量增大；當沖泡時間為25 min時，花青素的溶出量最大，達6.82 mg/g；之后，茶湯中花青素的含量又逐漸減少。沖泡時間過短，玫瑰茄花未被充分浸泡，花青素還未大量溶出；但沖泡時間過長，花青素因受熱易降解，且其他雜質組分的逐步溶出將導致茶湯中花青素含量降低[1，7]。

2.1.2 沖泡溫度對花青素溶出量的影響

沖泡溫度對花青素溶出量的影響見圖2。

圖2 沖泡溫度對花青素溶出量的影響Fig.2 Effect of brewing temperature on the release of anthocyanidins

由圖2可知，沖泡溫度對玫瑰茄茶湯中花青素溶出有顯著影響。隨著沖泡溫度升高，花青素溶出量呈先增加后降低的趨勢；其中，在70℃時花青素的溶出量最大，為6.88 mg/g。溫度較低時，分子的運動速度較慢，花青素溶出量較小；隨著溫度的升高，花青素的溶出速度增加，但當沖泡溫度高于70℃時，花青素溶出量逐漸下降，因為花青素在溫度較高的條件下，結構易被破壞，發生降解，溫度越高，降解速度越快[20-21]。

2.1.3 茶水比對花青素溶出量的影響

茶水比對花青素溶出量的影響見圖3。

由圖 3 可知，當茶水比在 1∶20（g/mL）～1∶40（g/mL）時，花青素溶出量呈上升趨勢，茶水比為1∶40（g/mL）時，溶出量達到最大值6.90 mg/g。原因可能為水的用量增多有利于花青素的溶出。但茶水比小于1∶40（g/mL）時花青素溶出量下降，原因可能為液體比例過大會稀釋提取濃度，使花色苷含量降低[21]，且水量過大時，花色苷分子間作用力變小，其穩定性下降容易分解[7，22]。

圖3 茶水比對花青素溶出量的影響Fig.3 Effect of tea-water ratio on the release of anthocyanidins

2.1.4 沖泡時間對總黃酮溶出量的影響

沖泡時間對總黃酮溶出量的影響見圖4。

圖4 沖泡時間對總黃酮溶出量的影響Fig.4 Effect of brewing time on the release of flavonoids

通過圖4可知，在20 min～35 min范圍內，沖泡時間過短，黃酮類化合物溶出不徹底，隨著沖泡時間的延長，總黃酮溶出量逐漸增大；當沖泡至35 min時，總黃酮溶出量最大為57.28 mg/g；沖泡時間過長時，總黃酮溶出量減少，原因可能為黃酮類化合物在高溫條件下易發生氧化[23]，也可能是玫瑰茄細胞內其他成分的溶出，干擾了黃酮類化合物的釋放[24]。

2.1.5 沖泡溫度對總黃酮溶出量的影響

沖泡溫度對總黃酮溶出量的影響見圖5。

圖5 沖泡溫度對總黃酮溶出量的影響Fig.5 Effect of brewing temperature on the release of flavonoids

通過圖5可知，隨著溫度不斷升高，玫瑰茄總黃酮溶出量增大，在70℃時總黃酮的溶出量達最大值57.22 mg/g。隨著溫度繼續升高，總黃酮溶出量反而呈下降趨勢。其原因可能是溫度的升高促進了黃酮類物質的溶出，但水溫過熱影響其結構的穩定性，一些熱敏性的黃酮類組分逐漸分解[25]；此外，水溫過高時使其他非黃酮類雜質溶出，導致黃酮溶出量降低。

2.1.6 茶水比對總黃酮溶出量的影響

茶水比對總黃酮溶出量的影響見圖6。

圖6 茶水比對總黃酮溶出量的影響Fig.6 Effect of tea-water ratio on the release of flavonoids

通過圖 6 可知，當茶水比在 1∶30（g/mL）～1∶50（g/mL）間時，玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量隨茶水比的降低逐漸增大；當茶水比為1∶50（g/mL）時，總黃酮溶出量最大為 56.84 mg/g；當茶水比低于 1∶50（g/mL），總黃酮溶出量逐步降低。其原因可能為，當用水量較少時，玫瑰茄中的黃酮類化合物不能完全溶出；用水量太多，可能導致玫瑰茄中其他雜質的溶出，影響黃酮的溶出量[26]，且因水的稀釋作用，造成茶湯中總黃酮含量的下降。

2.2 正交試驗結果

玫瑰茄花青素的正交試驗結果見表3。

表3 玫瑰茄花青素的正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal experiment regarding anthocyanidins from roselle calyces

由表3的數據結果可知，各因素對玫瑰茄茶湯中花青素溶出量影響的先后順序為：C＞B＞A，即茶水比＞沖泡溫度＞沖泡時間。確定的最優組合為A3B2C3，即沖泡時間30 min，沖泡溫度70℃，茶水比1∶50（g/mL）。

因為正交表中沒有上述最優條件的組合，為進一步考察試驗的準確性，在該最優沖泡條件下，進行3次驗證試驗，測得玫瑰茄茶湯中花青素的溶出量為7.94mg/g，高于正交試驗中的最高溶出量7.82 mg/g，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.81%，表明該沖泡條件重復性好，可為玫瑰茄花茶沖泡中花青素的有效釋放提供理論依據。

玫瑰茄總黃酮的最佳沖泡工藝優化的正交試驗設計及結果見表4。

表4 玫瑰茄總黃酮的最佳沖泡工藝優化的正交試驗設計及結果Table 4 The results of orthogonal experiment regarding flavonoids from roselle calyces

由表4結果可知，各因素對玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量影響的先后順序為：F＞G＞E，即沖泡溫度＞茶水比＞沖泡時間。最優沖泡條件組合為E3F3G2，即沖泡時間40 min，沖泡溫度80℃，茶水比1∶50（g/mL）。該最優組合恰好在正交試驗表中，且所得總黃酮溶出率值最大為58.77 mg/g。

綜合以上正交試驗結果可以發現，玫瑰茄花茶中花青素和總黃酮沖泡的最佳條件參數不盡相同。在茶水比均為1∶50（g/mL）的條件下，花青素有效溶出的最適條件為70℃沖泡30 min，而總黃酮有效溶出的最適條件為80℃沖泡40 min。花青素是玫瑰茄中黃酮類化合物最重要的一大類，除此之外，還包含其他的黃酮類成分，如棉子皮亭、玫瑰茄紅及其各自的配糖體、原兒茶酸、丁香酚，以及甾醇類的β-谷固醇、麥角固醇等。在沖泡玫瑰茄花茶時，除花青素外，其它具有水溶性的黃酮類化合物也會隨同溶出。因此，在沖泡時，針對花青素和總黃酮有效溶出的沖泡條件不完全相同。

3 結論

本研究以玫瑰茄花茶茶湯中花青素及總黃酮的溶出量為指標，利用單因素試驗確定沖泡時間、沖泡溫度和茶水比對花青素及總黃酮溶出量的影響規律，在此基礎上，進一步通過正交試驗確定花青素及總黃酮有效溶出的最佳沖泡條件。為使花青素有效溶出，玫瑰茄花茶的最佳沖泡方式為：沖泡時間30 min，沖泡溫度70℃，茶水比1∶50（g/mL），花青素溶出量可達7.94 mg/g。為使總黃酮有效溶出，玫瑰茄花茶的最佳沖泡方式為：沖泡時間40 min，沖泡溫度80℃，茶水比1∶50（g/mL），總黃酮溶出量為 58.77 mg/g。本試驗優化所得的花青素和總黃酮的最佳沖泡條件不盡相同，消費者可依據自身的喜好和需求選擇合適的沖泡條件。