產(chǎn)胞外多糖酵母菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

馬巖石，劉韓，裴芳藝

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處，黑龍江齊齊哈爾161000）

微生物多糖是細(xì)菌、真菌等在生長代謝過程中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的一類多糖[1]。酵母多糖分為胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）和胞壁多糖[2]，與胞壁多糖相比，胞外多糖更易與菌體分離，且在水溶液中呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)[3-4]。酵母EPS主要由半乳糖和葡萄糖組成，其中酵母葡聚糖是第一個被發(fā)現(xiàn)具有免疫活性的葡聚糖[5]，有抗腫瘤、抵抗微生物感染、抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，預(yù)防糖尿病、心血管疾病和控制體重等作用[6-7]。但截止到目前，酵母菌EPS的很多特性未得到解析，因此研究酵母EPS具有較強(qiáng)的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。孫曉萌等從海參腸道內(nèi)分離出可產(chǎn)EPS的季也蒙假絲酵母（Candida guilliermind）HS-J9，對所產(chǎn)EPS抗氧化能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，EPS2-1具有較強(qiáng)的抗氧化活性和還原力[8]。馬文錦從膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CM-1和 CICC 33013液體培養(yǎng)基中分別分離得到水溶性EPS，其產(chǎn)量分別為7.35 g/L和6.2 g/L，對其EPS結(jié)構(gòu)、生物活性及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異進(jìn)行了分析，彌補(bǔ)了R.mucilaginosa產(chǎn)EPS這一領(lǐng)域的技術(shù)空白[9]。

鎖擲孢酵母屬（Sporidiobolus）包含鎖擲孢酵母（S.johnsonii）、小孢子鎖擲孢酵母（S.microsporus）、近玫色鎖擲孢酵母（S.pararoseus）、魯寧鎖擲孢酵母（S.ruinenii）、赭色鎖擲孢酵母（S.salmonicolor）[10]。其中S.pararoseus作為一類非常規(guī)酵母，早期研究主要集中在分類學(xué)及生態(tài)分布等方面[11]，但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)此類酵母在環(huán)境治理、生物防治、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著突出的作用[12]。S.pararoseus細(xì)胞不僅可以積累油脂、產(chǎn)生色素還可以代謝EPS等有益代謝產(chǎn)物[13-14]。張可可等在煙草廢水中分離出一株具有產(chǎn)油脂和色素潛力的S.pararoseus，為有機(jī)釀造廢水的資源化利用提供參考[15]。趙利娜等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對S.pararoseus進(jìn)行體外降解展青霉素（patulin，PAT）研究，其結(jié)果為推動生物法控制及降解PAT做出一定貢獻(xiàn)[16]。性能優(yōu)良的菌種，與菌種生長相匹配的發(fā)酵條件決定發(fā)酵過程的成敗[17]。發(fā)酵過程的碳源和氮源的添加量、培養(yǎng)基的初始pH值和發(fā)酵過程各參數(shù)的控制是影響酵母EPS產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[18]。本試驗以葡萄園土壤為試驗材料，利用YPD和WL選擇培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)EPS的菌株，通過顯微形態(tài)觀察、菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及18S rDNA技術(shù)對所獲得菌種進(jìn)行鑒定，并以該菌株為出發(fā)菌株，通過響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)EPS條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

土壤：取自齊齊哈爾市周邊某葡萄園。

1.1.2 試劑

生理生化試劑：葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、乳糖、纖維二糖、松三糖、棉子糖、核糖、木糖、鼠李糖、水楊苷、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、肌醇、七葉苷、馬尿酸、硝酸鹽、亞硝酸鹽、尿素酶、賴氨酸脫羧酶：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；海藻糖、菊糖、淀粉、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、赤蘚糖醇、核糖醇、L-精氨酸雙水解酶、硫化氫：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。葡萄糖、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、氯化鈉、苯酚、硫酸、三氯乙酸：均為分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司。

酵母基因組DNA提取試劑盒（DP307-02）、Lyticase溶壁酶（3000 U）（RT410-02）、6×DNA 電泳 Loading Buffer（RT201-01）、Agarose LE（RT101）、50×TAE Buffer（RT204）、GeneRed 核酸染料（RT211）、D2000 DNA Marker （MD114-01）、D15000DNA Marker（MD110-01）、2×Taq PCR Mastermix（KT201-02）：天根生化科技（北京）有限公司；山梨醇buffer（DZSL0332）：北京酷來搏科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD瓊脂培養(yǎng)基（貨號HB5193）、YPD液體培養(yǎng)基（貨號HB5193-1）、WL營養(yǎng)瓊脂（貨號HB0300）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

產(chǎn)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15，硫酸銨 15，硫酸鎂1.8，氯化鈣0.28，磷酸氫二鉀0.24，氯化鈉0.6，蒸餾水，1 L，pH值7.0，121℃滅菌 15 min，用于產(chǎn)糖菌株的篩選。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)（22331Hamburg）、臺式高速大容量冷凍離心機(jī)（5804R）：德國 Eppendorf公司；pH計（FE28）、電子天平（AL204）：梅特勒-托利多集團(tuán)；可見分光光度計（V-5000）：上海元析儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162）、落地振蕩器（HZQ-211C）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR儀（C1000-touch）、全自動熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc MP）：美國Bio-rad；光學(xué)顯微鏡（CX31）：日本 Olympus公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 S.pararoseus菌株的初步分離篩選

稱量10.0 g葡萄園中采集的土壤，放入100 mL無菌水內(nèi)振蕩培養(yǎng)1 h，制成菌懸液，梯度稀釋至10-7，分別取每個梯度的稀釋液0.1 mL涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，每個稀釋度作2個平行樣，28℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落保存?zhèn)溆谩?/p>

將保藏的菌株用YPD液體培養(yǎng)基活化后，三區(qū)劃線的方法接種于WL固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d后，挑取單菌落保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)特征觀察

將菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3 d，在顯微鏡下觀察菌體的形狀、大小及繁殖方式。分別將菌株三區(qū)劃線于YPD、WL固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，觀察其形成的菌落顏色、質(zhì)地、表面形態(tài)、邊緣形態(tài)及培養(yǎng)基顏色變化情況[10，19]。

1.2.3 高產(chǎn)EPS菌株的篩選

利用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中EPS含量[20]，篩選出高產(chǎn)EPS的菌株。取1.5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，將上清液適當(dāng)稀釋后取1 mL與1 mL體積分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液混勻，靜置冷卻至25℃后，于波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中EPS的含量。

1.2.4 生理生化特征鑒定

按照試劑盒說明書要求，制備菌懸液，接種生化試劑管，28℃培養(yǎng)2 d后觀察[10，22]。同化試驗碳源主要包括葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳糖、纖維二糖、松三糖、棉子糖、菊糖、淀粉、核糖、木糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、水楊苷、甘油、赤蘚糖醇、核糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、肌醇、七葉苷、馬尿酸。氮源主要包括硝酸鹽，亞硝酸鹽和賴氨酸脫羧酶、L-精氨酸雙水解。其它生化試驗主要包括：尿素酶、葡萄糖產(chǎn)氣試驗、硫化氫試驗。

1.2.5 18S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

基因組DNA提取：活化的種子液經(jīng)12 000 r/min離心1 min后收集沉淀。按照基因組DNA提取試劑盒說明書，提取基因組DNA。以NS1：5'GTAGTCATATGCTTG TCTC 3'；NS6：5'GCATC ACAGA CCTGT TATTG CCTC 3'為引物進(jìn)行18S rDNA部分序列擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Mastermix 25 μL；模板 DNA 2 μL；上下游引物各1 μL；補(bǔ)加ddH2O至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，35個循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠驗證后，送上海生工生物公司測序。測序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GeneBank登錄號。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST，利用 MEGA 5.0，Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株同源性和種屬水平[23-24]。

1.2.6 Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

根據(jù)基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基的成分，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定影響EPS產(chǎn)量的8個因素（葡萄糖、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、氯化鈉、裝液量、初始pH值），及每個因素的水平范圍。以EPS產(chǎn)量Y為響應(yīng)值，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平。Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計因素與水平見表1，共進(jìn)行15組試驗，每組3個平行[25-26]。以2%的接種量接種，28℃140 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

表1 兩水平析因試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of factorial tests with two levels

1.2.7 中心組合試驗（central composite design，CCD）

根據(jù)PB試驗的結(jié)果，以EPS產(chǎn)量Y為響應(yīng)值，對EPS產(chǎn)量的影響因素葡萄糖、硫酸鎂、初始pH值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，得到最優(yōu)方案。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表2。

1.2.8 驗證試驗

多糖的提取參照DU等的方法[27]。菌株以2%接種量接種到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃140 r/min振蕩培養(yǎng)5 d得到發(fā)酵液。4℃、11 000 r/min離心20 min去除菌體。在上清液中加入3倍體積的預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，4℃過夜，4℃、11 000 r/min離心20 min收集沉淀，用適量去離子水溶解多糖沉淀，加入等體積的10%三氯乙酸，充分?jǐn)嚢瑁?℃靜置24 h，4℃、11 000 r/min離心20 min，去除沉淀。在上清中加入3倍體積的預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，4℃過夜，4℃、11 000 r/min離心20 min收集多糖沉淀，溶于50 mL去離子水中，裝入透析袋，4℃透析2 d，每8 h換1次水。

表2 中心組合設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計使用Design Expert 8.0；系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建使用MEGA 5.0；統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0，以p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著；繪圖使用Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗菌株的篩選

通過菌落形態(tài)觀察和苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中EPS含量，共得到4株具有產(chǎn)糖能力的S.pararoseus，EPS產(chǎn)量分別為PFY-B1菌株（3.58±0.12）g/L、PFY-F1菌株（2.92±0.19）g/L、PFY-G1 菌株（3.27±0.22）g/L、PFY-Z1 菌株（4.14±0.11）g/L（p＜0.05）。包怡紅等從自然界中篩選獲得1株可以產(chǎn)EPS的東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）Z20，EPS 產(chǎn)量為 1.137 g/L[28]。孫曉萌等從海參腸道中分離分離出可產(chǎn)EPS的C.guilliermind HS-J9，EPS產(chǎn)量為0.137 g/L[8]。與上述研究相比，本研究分離得到的酵母菌產(chǎn)糖能力相對較強(qiáng)。因此，選擇PFY-Z1菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 菌株形態(tài)觀察

菌株P(guān)FY-Z1在YPD、WL固體培養(yǎng)基上生長形態(tài)見圖1。

圖1 菌株P(guān)FY-Z1在YPD、WL平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain PFY-Z1 on YPD and WL agar plate

在YPD平板上培養(yǎng)前3 d與其它酵母菌株無明顯區(qū)別，但不隨著培養(yǎng)時間延長而改變顏色，觀察單菌落形態(tài)為表面凸起、有褶皺、不透明、圓形、邊緣鋸齒狀。該菌落形態(tài)與李僑飛在葡萄園采集樣品中分離得到的S.pararoseus Y16形態(tài)一致[29]。在WL平板上，培養(yǎng)初期單菌落表面有褶皺、圓形、邊緣鋸齒狀，培養(yǎng)4 d后表面褶皺逐漸消失，表面光滑。

顯微鏡觀察結(jié)果見圖2，細(xì)胞呈橢圓形，與一般酵母相似，表現(xiàn)出明顯的出芽生殖。

圖2 菌株P(guān)FY-Z1顯微形態(tài)觀察（640×）Fig.2 The microscopic morphology of strain PFY-Z1（640×）

2.3 生理生化鑒定

參考《常見與常用真菌》[22]及《酵母菌的特征與鑒定手冊》[10]，對菌株P(guān)FY-Z1的部分生理生化性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果見表3。菌株P(guān)FY-Z1在28℃培養(yǎng)時生長良好，可利用碳源種類較少，氮源利用率相對較好，生長無運(yùn)動性，尿素酶為陽性。

表3 菌株P(guān)FY-Z1的部分生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical results of the strain PFY-Z1

2.4 18S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

提取菌株P(guān)FY-Z1的基因組DNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增菌株的18S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在1 300 bp處獲得清晰條帶，結(jié)果見圖3。

PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank公布的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過比對發(fā)現(xiàn)該菌株與S.pararoseus相似度極高，同源性＞99%，結(jié)果上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GeneBank登錄號為MN956988。

圖3 菌株P(guān)FY-Z1的18S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Electrophoregram of 18S rDNA amplification products of PFY-Z1

應(yīng)用Mega5.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將菌株P(guān)FY-Z1與25株菌的核酸序列進(jìn)行比對，按比例繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。因此將該菌株命名為S.pararoseus PFY-Z1。

2.5 PB試驗

微生物發(fā)酵產(chǎn)EPS不僅受自身性質(zhì)影響，培養(yǎng)及成份和初始pH值對其EPS產(chǎn)量也具有顯著影響[30]。微生物只有在特定的條件下才能產(chǎn)生EPS，并且不同的條件會產(chǎn)生不同種類的EPS[31]。因此，本試驗在對菌株P(guān)FY-Z1產(chǎn)EPS單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計PB試驗，確定對菌株P(guān)FY-Z1產(chǎn)EPS具有顯著影響的因素。試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，回歸分析結(jié)果見表5。

圖4 Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株P(guān)FY-Z1的18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain PFY-Z1 18S rDNA base on using Neighbor-Joining method

表4 PB試驗設(shè)計及統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Experimental design and results of the PB design

表5 PB試驗回歸分析結(jié)果Table 5 Results of the regression analysis of the PB design

由表4可知，EPS產(chǎn)量從（2.49±0.11）g/L升到（6.74±0.18）g/L，說明培養(yǎng)基成分對發(fā)酵菌株產(chǎn)EPS有很大影響。根據(jù)PB試驗結(jié)果，得到模型擬合方程如下：EPS含量=4.04+0.73X1+0.26X2+0.66X3+0.042X4+0.15X5-0.22X6-0.18X7-0.79X8。

由表5可知，模型F值為12.33，兩水平析因試驗?zāi)Ｐ晚楋@著（p=0.031 6＜0.05），表明該模型具有重要意義，R2=0.970 5，說明存在97.05%的試驗數(shù)據(jù)可用該模型解釋，調(diào)整 R2=0.891 8，信噪比=10.465（＞4），證明該模型可以很好的擬合試驗數(shù)據(jù)。由p值可用于判斷各變量對EPS影響的顯著性可知，各變量對EPS影響顯著程度依次為 X8＞X1＞X3＞X2＞X6＞X7＞X5＞X4，即葡萄糖（X1）對菌株P(guān)FY-Z1的EPS產(chǎn)量影響顯著（p=0.012 1＜0.05），具有正效應(yīng)；硫酸鎂（X3）對菌株 PFY-Z1 的 EPS產(chǎn)量影響顯著（p=0.016 1＜0.05），具有正效應(yīng)；初始pH值對EPS產(chǎn)量影響極顯著（p=0.009 6＜0.01），具有負(fù)效應(yīng)。其他變量在PB試驗條件下對菌株的EPS產(chǎn)量無顯著影響，因此選擇葡萄糖、硫酸鎂、初始pH值3個因素進(jìn)行CCD試驗。碳源是影響微生物產(chǎn)EPS的重要因素，添加碳源的含量直接影響EPS的含量[32]。包怡紅等通過對I.orientalis Z20產(chǎn)糖培養(yǎng)基優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，乳糖和蔗糖基本不被利用合成EPS，果糖和葡萄糖相比，葡萄糖有利于EPS，對葡萄糖添加量進(jìn)行優(yōu)化后，結(jié)果顯示，添加8%葡萄糖時，EPS產(chǎn)量最大為2.046 g/L[28]。韓梅等的研究顯示，S.pararoseus JD-2產(chǎn)EPS的氮源中（NH4）2SO4最有利于EPS積累[33]。楊迎鳳等研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+對EPS的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，當(dāng)添加0.01%的MgSO4時，酵母菌YF-01的EPS產(chǎn)量為4.672 g/L[34]。馬文錦的研究顯示，當(dāng)MgSO4含量為0.1%時，R.mucilaginosa CICC33013的EPS產(chǎn)量為6.2 g/L[9]。趙英杰等[35]、包怡紅等[28]、楊迎鳳等[34]、韓梅等[17]的研究均顯示初始pH值在5～6范圍時，最有利于酵母菌產(chǎn)EPS，與本試驗結(jié)果相一致。

2.6 CCD試驗

菌株P(guān)FY-Z1產(chǎn)EPS含量CCD試驗結(jié)果見表6，回歸分析見表7。

表6 CCD試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimentaldesign and results of the CCD

表7 CCD試驗回歸分析結(jié)果Table 7 Results of the regression analysis of the CCD

由表6和表7可知，CCD試驗?zāi)Ｐ晚棙O顯著（p＜0.000 1），R2=0.942 9，說明存在94.29%的試驗數(shù)據(jù)可用該模型解釋，調(diào)整 R2=0.891 4，信噪比=11.84（＞4），變異系數(shù)CV=7.85%，表明試驗結(jié)果所得模型能夠較好的擬合試驗數(shù)據(jù)。葡萄糖含量（X1）和初始pH值（X8）及各變量二次項（X12、X32、X82）對菌株的 EPS 產(chǎn)量有極顯著影響（p＜0.01），硫酸鎂含量（X3）對菌株 EPS 產(chǎn)量有顯著影響（p＜0.05），X1X3、X1X8、X3X8對菌株的 EPS產(chǎn)量無顯著影響（p＞0.05）。各變量間的相互作用對菌株EPS產(chǎn)量影響見圖5～圖7。

圖5 葡萄糖和硫酸鎂對菌株產(chǎn)糖影響的等高線圖和曲面圖Fig.5 The contour plot and surface response of EPS yield vs glucose and MgSO4

圖6 葡萄糖和pH值對菌株產(chǎn)糖影響的高線圖和等曲面圖Fig.6 The contour plot and surface response of EPS yield vs glucose and pH

圖7 硫酸鎂和pH值對菌株產(chǎn)糖影響的等高線圖和曲面圖Fig.7 The contour plot and surface response of EPS yield vs MgSO4and pH

根據(jù)CCD試驗結(jié)果，得到模型擬合方程如下：EPS含量=6.52+0.49X1+0.3X3-0.63X8-0.14X1X3-0.036X1X8-0.14X3X8-0.52X12-0.76X32-0.73X82。模型方程中二次項系數(shù)均為負(fù)，可知該方程擬合的曲面開口朝下，方程有極大值。預(yù)測葡萄糖糖含量、硫酸鎂含量和初始pH值分別為17.34、1.98 g/L和5.3時，方程有極大值，EPS的預(yù)測產(chǎn)量為6.81 g/L。

變量間的相互作用關(guān)系可從等高線圖和曲面圖形狀看出，橢圓形表明變量間的相互作用有顯著影響，圓形則表明無顯著影響。由圖5可知，當(dāng)初始pH值為6時，葡萄糖和硫酸鎂的交互作用對EPS的合成影響不顯著；以葡萄糖含量為定值，隨硫酸鎂含量的增加，EPS產(chǎn)量先增加再減少，硫酸鎂含量在接近1.8 g/L時，EPS含量最高，以硫酸鎂含量為定值，EPS含量隨葡萄糖含量的增加呈現(xiàn)先上升后趨于緩慢下降趨勢，葡萄糖含量在16 g/L～18 g/L時，EPS含量最高。由圖6可知，當(dāng)硫酸鎂為1.8 g/L時，葡萄糖和初始pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著。由圖7可知，當(dāng)葡萄糖為15 g/L時，初始pH值和硫酸鎂的交互作用對EPS的合成影響不顯著，以硫酸鎂為定值，EPS的產(chǎn)量隨pH值的升高而降低。

2.7 驗證試驗

使用中心組合試驗中預(yù)測最佳產(chǎn)EPS試驗點進(jìn)行驗證試驗，在此條件下，菌株P(guān)FY-Z1的EPS含量為（6.74±0.13）g/L，與預(yù)測值6.81 g/L無顯著差異（p＞0.05）。響應(yīng)面法優(yōu)化后，菌株P(guān)FY-Z1產(chǎn)EPS水平是優(yōu)化前（4.14±0.11 g/L）的1.63倍。趙英杰等從乳扇中獲得9株產(chǎn)EPS能力較好的酵母菌株，其中金黃色隱球酵母（Cryptococcus aureus）DF-12產(chǎn)EPS能力最強(qiáng)，優(yōu)化后EPS含量為3.511 g/L[35]。PAVLOVA等從南極分離出4株產(chǎn)糖酵母，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中EPS產(chǎn)量為1.75 g/L～2.63 g/L[36]，優(yōu)化后羅倫隱球菌（Cryptococcus laurentii）AL100在發(fā)酵96 h的時候可以產(chǎn)生6.4g/L的EPS[37]。與此相比，本試驗獲得S.pararoseus PFY-Z1不僅自身EPS產(chǎn)量相對較高，而且優(yōu)化后EPS產(chǎn)量也高于目前所報道的大部分菌株。

3 結(jié)論

本試驗從葡萄園土壤中分離得到一株高產(chǎn)EPS的酵母菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗和分子生物學(xué)試驗鑒定該菌株為S.pararoseus，并命名為S.pararoseus PFY-Z1。以該菌株為出發(fā)菌株，采用響應(yīng)面方法優(yōu)化菌株產(chǎn)EPS條件。首先，兩水平析因試驗設(shè)計結(jié)果表明，葡萄糖、硫酸鎂和無初始pH值對S.pararoseus PFY-Z1產(chǎn)EPS有顯著影響。CCD試驗表明葡糖糖含量、硫酸鎂含量和初始pH值分別為17.34 g/L、1.98 g/L 和 5.3時，EPS的產(chǎn)量最高為（6.74±0.13）g/L，是優(yōu)化前（4.14±0.11 g/L）的1.63倍。因此，利用S.pararoseus PFY-Z1發(fā)酵產(chǎn)EPS，不僅為EPS的生產(chǎn)提供了菌種來源，也為今后利用S.pararoseus大規(guī)模生產(chǎn)EPS提供了理論基礎(chǔ)。