硒素對草莓果實抗氧化活性及相關物質含量的影響

張守花，許真，蔣安，王永剛

（鶴壁職業技術學院，河南鶴壁458030）

硒是人體必需的微量元素之一，在合成硒代半胱氨酸時，作為酶結構上的一部分[1]，具有清除自由基、抗氧化、抗癌和提高機體免疫力的作用[2]。人體的多種疾病與缺硒有關，如克山病、癌癥等[3]。我國大部分地區處于缺硒地帶[4]，成人每天攝入的硒元素量遠遠低于生物需要量[5]。很多研究已證實，食用含有豐富植物素的植物對人體健康因子的激發具有促進作用。人類的健康和植物營養之間具有顯著地正向關系，很多植物需要的基本營養成分同樣也被人類和動物需要，多數情況下，具有相似的作用機理[1]，因此，提高作物中硒元素的含量是人體補硒最安全經濟的方法。

草莓（Fragaria ananassa Duch）是薔薇科草莓屬多年生草本漿果植物，鮮嫩多汁，營養豐富，其抗氧化能力是蘋果、柑橘等園藝作物的2倍～11倍[6]。草莓果實中抗氧化物質對人類健康的影響越來越受到關注，抗氧化活性也成為衡量其果實品質的重要指標之一[7]。

迄今為止，有關硒肥對草莓果實的抗氧化活性及相關物質含量的影響尚未見報道。本試驗通過對開花期草莓施用不同濃度的亞硒酸鈉（Na2SeO3）溶液，對其果實中總硒含量和抗氧化活性及相關物質含量進行測定，以期為提高草莓品質，生產高抗氧化活性的草莓提供科學合理的施硒方法，為生產富硒果蔬提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓：品種為“章姬”“紅顏”，本地栽培。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海如吉生物科技有限公司；福林-酚試劑：上海躍騰生物科技有限公司；硝酸（優級純）、亞硒酸鈉、FeSO4、水楊酸、香草醛、亞硝酸鈉、2，6-二叔丁基對甲酚（2，6-di-tertbutyl-4-methyl phenol，BHT）、鄰苯三酚、甲醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2000型紫外分光光度計：上海尤尼可儀器有限公司；AFS-920型雙道原子熒光光譜儀：北京吉天儀器有限公司；Agilent 1290 InfinityⅡLC型色譜儀：安捷倫公司；TP-114電子分析天平：賽多利斯儀器有限公司；TGL-16gR型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 草莓栽培

試驗在本地大棚內進行。2016年9月10日選取3葉1心生長健壯，整齊一致的草莓苗進行定植，起壟栽培，每壟2行，行距為40 cm，株距為25 cm。待草莓長至初花期，開始進行葉面噴施亞硒酸鈉溶液，同時設清水噴施為對照（CK），噴施程度以葉面均勻布滿霧狀溶液為標準。試驗選擇硒濃度為 0（CK）、5、10、15、20、25 mg/L共6個處理，每個處理20株，3次重復。每隔10 d噴施一次，直至初果期（果實顏色為綠色）停止噴施。

1.3.2 樣品預處理

選取果實發育充分，著色面積達到90%左右，大小基本一致，無病蟲害，無機械傷的果實采收。取不同處理的果實，清洗后切碎，在液氮中快速冷凍，用封口袋包裝，置于-18℃冰箱中保存，用于硒、抗氧化活性、總酚、原花青素、總黃酮、維生素C和維生素E的含量測定。

1.3.3 測定方法

1.3.3.1 總硒含量測定

稱取5 g樣品于微波消解管中，加入16 mL硝酸，消化過夜，用微波消解儀消解。將消解液轉移至100 mL容量瓶，用高純水定容，濾紙過濾，取10 mL濾液，加入2.5 mL HCl，沸水浴2 h，用熒光光譜儀測定總硒含量。每份樣品平行測定3次，取平均值[8]（下同）。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

取草莓汁2 mL，加入0.1 mg/mL DPPH溶液2 mL，混勻，放置30 min，在517 nm處測A樣品吸光光度值，計算清除率[9]。

DPPH 自由基清除率/%=（A空白-（A樣品-A對照）/A空白）×100

式中：A樣品為樣液與DPPH溶液混合后的吸光光度值；A對照為樣液與溶劑混合后的吸光光度值；A空白為溶劑與DPPH溶液混合后的吸光光度值。

1.3.3.3 OH自由基清除率的測定

依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、草莓汁各2 mL，混勻，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混勻，放置15 min，在510 nm處測A樣品吸光光度值，計算清除率[9]。

OH 自由基清除率/%=（A空白-（A樣品-A對照）/A空白）×100

式中：A樣品為樣液加H2O2的吸光光度值；A對照為樣液未加H2O2的吸光光度值；A空白為空白液的吸光光度值。

1.3.3.4 O2-自由基清除率的測定

取0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，加入1 mL草莓汁和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，25℃水浴反應4 min，加入8 mol/L HCl溶液0.5 mL，320 nm處測A樣品吸光光度值，計算清除率[9]。

O2-自由基清除率/%=（A空白-（A樣品-A對照）/A空白）×100

式中：A樣品為樣液加鄰苯三酚的吸光光度值；A對照為樣液未加鄰苯三酚的吸光光度值；A空白為空白液的吸光光度值。

1.3.3.5 總酚含量測定

去籽草莓果肉打漿、離心，取草莓汁，加4倍蒸餾水稀釋。精確量取稀釋后的樣品溶液0.5 mL，加30 mL蒸餾水混勻，加入2.5 mL福林酚試劑，7.5 mL20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至50 mL，混勻，75℃水浴10 min，冷卻后在760 nm處測其吸光度[10]。

1.3.3.6 原花青素含量測定

凍干樣品粉碎，加入80%甲醇溶液，28℃振蕩24h，4 000 r/min離心10 min，取上清液過濾，裝于棕色瓶，-4℃保存，待用。用錫箔紙將試管包嚴，僅留管口用于加樣。取上清液1 mL，加入40 g/L香草醛甲醇溶液6 mL，再加入3 mL濃鹽酸，混勻，室溫25℃條件下，暗處放置15 h，在500 nm波長處比色[11]。

1.3.3.7 總黃酮含量測定

凍干樣品粉碎，加入80%甲醇溶液，28℃振蕩24 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液過濾。取濾液10 mL與1 mL 50 g/L亞硝酸鈉溶液混合，5 min后加入100 g/L六水氯化鋁1 mL，混勻，反應5 min后，再加入1 mol/L氫氧化鈉10 mL，充分混勻，15 min后在510 nm波長處測定吸光度[12]。

1.3.3.8 維生素C含量測定

取去籽草莓果肉5.0 g，研磨均勻置于錐形瓶中，加入2%偏磷酸溶液10 mL，塞緊瓶口，30℃，超聲輔助提取30 min，加入10 mL蒸餾水，13 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL加蒸餾水定容至10 mL，在246 nm處測定吸光度[13]。

1.3.3.9 維生素E含量測定

取少量去籽草莓果肉，研磨細碎后取0.1 g，加入含0.01%BHT的甲醇∶氯仿（2∶1，體積比）混合液2 mL，避光靜置20 min，然后加入0.8 mL氯仿和1.5 mL水，振蕩混勻，13 000 r/min下離心15 min，取下層蒸干，用二氯甲烷∶甲醇（1∶5，體積比）的混合液溶解至800 μL，置于樣品瓶中上機測定，進樣量20 μL。色譜柱為 Li-CHrospher 100 Diol 250 mm×4 mm，粒徑 5 μm；流動相，甲醇 ∶水（97∶3，體積比）；流速 1.2 mL/min；熒光激發292 nm，發射330 nm[14]。

1.4 數據分析

數據采用SPSS12.0軟件進行數據分析，利用Microsoft Excel 2007繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同硒處理濃度對草莓果實中總硒含量的影響

植物在一定硒濃度范圍內，對硒的吸收能力隨硒濃度的增加而增大，但施硒過量時，植物體富硒能力下降，嚴重時會對植物體造成不同程度的傷害[15]。不同硒濃度處理對草莓果實中總硒含量的影響見圖1。

圖1 不同硒濃度處理對草莓果實中總硒含量的影響Fig.1 Effect of different selenium treatments on selenium content of strawberry

由圖1可知，清水（CK）噴施時，果實中硒含量非常低，隨著硒濃度的增加，“章姬”“紅顏”果實中硒含量都呈明顯上升趨勢，當硒濃度為20 mg/L時，果實中的硒富集量分別為 35.32、40.12 μg/kg，達最大值；硒濃度為25 mg/L時，果實中硒含量幾乎沒有變化，說明果實對硒的吸收能力已達飽和狀態。由此可見，提高硒處理濃度對草莓果實中硒的積累是有積極作用的，草莓對外源硒的吸收具有飽和性。

“紅顏”對硒的富集能力高于“姬章”，可能是因為品種間的差異性。

2.2 不同硒處理濃度對草莓果實抗氧化活性的影響

研究發現，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）能清除生物體內過多自由基，而硒對該酶具有活性調節作用[16]。不同硒濃度處理的草莓對自由基的清除作用如圖2～圖4所示。

圖2 不同硒濃度處理的草莓對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical-scavenging capability of strawberry by different selenium treatments

圖3 不同硒濃度處理的草莓對OH自由基的清除作用Fig.3 OH radical-scavenging capability of strawberry by different selenium treatment

圖4 不同硒濃度處理的草莓對O2-自由基的清除作用Fig.4 O2-radical-scavenging capability of strawberry by different selenium treatments

由圖2～圖4可以看出，隨著硒濃度的增加，“章姬”“紅顏”對自由基的清除率均比對照增加。硒濃度為 20 mg/L 時，“章姬”對 DPPH·、·OH、O2-·3 種自由基的清除率達最大值，分別為85.09%、58.94%和63.3%；“紅顏”對3種自由基的清除率也達最大值，分別為90.17%、66.87%和70.04%。硒濃度為25 mg/L時，兩品種對自由基的清除率不再有顯著變化，說明對草莓果實噴施適宜濃度的硒溶液，可以增加其對自由基的清除能力，但草莓對硒的吸收具有飽和性，達到一定程度后，抗氧化能力將不再增加。究其原因，主要是硒作為一種誘發因子，以硒代半胱氨酸或硒代甲硫氨酸的形式參與到GSH-Px的結構中，激活GSH-Px合成的相關基因，從而提高酶的活性，但隨著硒濃度的增加，植物體內GSH-Px合成達到飽和，再增加硒濃度，酶活性也不再增加，自由基清除率也就不再變化[17]。由于品種間差異，對硒的吸收能力及自身抗氧化物質含量不同造成施硒后“紅顏”對自由基的清除率高于“章姬”。

2.3 不同硒處理濃度對草莓果實抗氧化物質含量的影響

不同硒濃度處理對草莓果實中抗氧化物質含量的影響如表1所示。

2.3.1 對總酚含量的影響

酚類物質通過調節細胞氧化還原狀態，有效抑制或清除活性氧自由基，起到抗氧化作用[18]。噴施硒溶液后，草莓果實中的總酚含量隨硒濃度的增加而逐漸升高。如表 1 所示，與對照相比，5、10、15、20 mg/L和25 mg/L的處理均能顯著提高果實中的總酚含量，硒濃度為20 mg/L時，“章姬”“紅顏”果實中的總酚含量均達最大值，分別為298.7 mg/100 g和295.3 mg/100 g，比對照提高了9.5%和12.7%，差異顯著。這是因為苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是連接初級代謝和苯丙烷、苯丙氨酸類代謝的關鍵酶，參與酚類物質的合成，PAL活性增高，酚類物質含量呈一致性增加[19]。由于PAL活性與植物體中硒含量有極顯著的正相關性[20]，隨著果實中硒含量的增加，PAL活性逐漸增強，促進果實中酚類物質的合成和積累。

表1 不同硒濃度處理對草莓果實中抗氧化物質含量的影響Table 1 Effect of different selenium treatments on antioxidant substances content of strawberry

2.3.2 對原花青素含量的影響

原花青素（proantho anthocyan，PA）又叫縮合單寧，是廣泛存在于高等植物界中的一類聚多酚化合物，具有強大的清除自由基、抗氧化能力[21]。由表1可知，隨著硒溶液濃度的增加，草莓果實中原花青素含量越來越高。與對照相比，“章姬”的原花青素含量分別增加1.2%、4.9%、6.6%、11.5%和9.4%，“紅顏”的原花青素含量分別增加2.3%、5.2%、8.9%、13.6%和11.4%。施硒濃度為20 mg/L時原花青素含量最高，“章姬”為22.33 mg/100 g，“紅顏”為23.41 mg/100 g，而25 mg/L處理時原花青素含量稍有降低，究其原因可能與原花青素合成途徑有關，原花青素合成經歷公共苯丙烷途徑→核心類黃酮-花青素途徑→PA特異途徑[22]，而PAL是苯丙烷途徑的第一個關鍵酶，適量硒可以提高PAL的活性[20]，PAL活性增強，原花青素含量相應增加。

2.3.3 對總黃酮含量的影響

草莓果實中總黃酮的含量隨硒溶液濃度的增加而升高，硒濃度為20mg/L時，“章姬”“紅顏”的總黃酮含量均達最大值，分別為40.24 mg/100 g和44.59 mg/100 g，比對照提高了19.6%和24.4%；硒濃度為25 mg/L時，總黃酮含量呈下降趨勢，這可能是因為，黃酮類化合物由苯丙烷類代謝途徑產生，PAL催化苯丙烷類代謝的第一步，與黃酮類化合物的生成有密切關系。硒含量增加，PAL活性增強，總黃酮含量上升，硒過高時可能加快了其它次生代謝產物合成，不利于黃酮類物質合成[20]。

2.3.4 對維生素C含量的影響

維生素C是一類存在于植物綠色組織中的水溶性抗氧化物質，在清除自由基，提高植物抗脅迫能力方面具有重要意義[23]。維生素C含量隨施硒濃度變化動態如表1所示，隨著硒濃度的增加，果實中維生素C含量也逐漸升高，濃度為20 mg/L時達最大值，“章姬”為64.24 mg/100 g，比對照提高了18.7%；“紅顏”為84.43 mg/100 g，比對照提高了16.2%。這是因為硒被吸收后會形成硒蛋白能提高植物的合成代謝能力，使維生素C合成量增加；植物對硒的吸收具有飽和性，達到一定量后不再吸收，合成代謝能力隨之減弱，維生素C含量也相應下降。

2.3.5 對維生素E含量的影響

維生素E又名生育酚，是一類由光合組織合成的脂溶性強抗氧化劑[24-25]，能減弱脂肪氧合酶對不飽和脂肪酸的傷害，清除生物體內自由基，延緩衰老[26]。試驗結果表明，隨著硒溶液濃度升高，草莓果實中維生素E含量顯著提高，硒濃度為20 mg/L，“章姬”“紅顏”果實中的維生素E含量均達最大值，分別比對照提高了52.1%和100%；硒濃度為25 mg/L，分別比對照提高了47.3%和89.7%，與20 mg/L處理差異不顯著，說明適宜濃度的外源硒溶液對維生素E的合成具有促進作用，這可能是因為硒元素能調控和促進植物葉綠素的合成代謝，提高光合速率[27]，增強光合組織功能，維生素E由光合組織合成，硒元素通過對光合組織的積極作用間接促進了維生素E的合成。

3 結論

本試驗考慮到硒素來源的毒性及對環境的影響，選擇了風險性較小的亞硒酸鈉為外源硒素，并采用葉面噴施的方式，減少過量硒素對土壤和植物的危害。

由試驗結果可知，一定范圍內，隨著硒濃度的增加，草莓對硒的吸收能力、抗氧化活性和抗氧化物質含量呈上升趨勢。葉面噴施硒濃度為20 mg/L時，草莓對外源硒的富集力最強，對DPPH·、·OH、·O2-3種自由基的清除率最大，總酚、原花青素、總黃酮、維生素C、維生素E含量都顯著高于對照，硒濃度為25 mg/L時，草莓果實對硒的吸收能力、抗氧化活性和抗氧化物質含量都沒有顯著增加，部分呈下降趨勢，因此，可噴施20 mg/L的硒溶液，提高草莓果實的抗氧化活性及相關物質含量，提高草莓品質，延長保質期。