輻照處理對(duì)柄曲霉素的降解效果研究

趙亞榮，王瓊珊，王旭，劉香香，王富華，*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心，廣東廣州510640；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；3.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

真菌毒素（mycotoxins）是真菌在合適的條件下代謝產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中有30多種真菌菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物和人類具有致病性。目前，真菌毒素污染已經(jīng)成為重要的食品安全問題。因此，在人類密切關(guān)注食物和食品衛(wèi)生質(zhì)量安全的今天，真菌毒素對(duì)食物的污染已成為不可忽視的問題。其中，黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的研究最為深入，且取得了很大的進(jìn)展，而新近的研究表明，AFB1的代謝合成前體物質(zhì)柄曲霉素（sterigmatocystin，STC）已逐漸成為真菌毒素研究中的另一個(gè)熱點(diǎn)。

在生物代謝過程中，STC是AFB1的倒數(shù)第二個(gè)前體，二者共享同一條代謝途徑。目前，由于缺乏相關(guān)報(bào)道或流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)來評(píng)估其致癌性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將STC劃分為2B級(jí)致癌物，即被認(rèn)為是對(duì)人類可能致癌的物質(zhì)[1-2]。2013年6月7日應(yīng)歐盟委員會(huì)（European Commission，EC）要求，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）對(duì)食品和飼料樣品中的STC對(duì)公眾的健康風(fēng)險(xiǎn)發(fā)布了意見[3]。很多研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，STC可污染谷物、谷物加工品、堅(jiān)果、奶酪和調(diào)味料等食品，并可在食物中長期存留，隨后通過食物鏈間接地進(jìn)入人體，造成食品安全問題，威脅人類和動(dòng)物的健康[4-5]。

輻照處理是一個(gè)傳統(tǒng)的物理過程，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品上的殺菌、滅蟲、保鮮以及降低致敏源的致敏作用等[6-9]。食品輻射較傳統(tǒng)的滅菌、保鮮等方法相比，可節(jié)省能耗，且處理后無污染、無殘留；同時(shí)，輻射技術(shù)可以在常溫條件下進(jìn)行，不會(huì)引起被輻射物品內(nèi)部溫度的升高，因此可較好地保持食品原有的特性。大量的研究已經(jīng)表明紫外照射、γ射線、電子束、X射線和微波等輻射技術(shù)可有效去除農(nóng)產(chǎn)品中的真菌毒素。2007年，Nagy等研究報(bào)道γ射線輻照可有效降解小麥、大麥和玉米中的伏馬菌素，當(dāng)輻照劑量為7 kGy時(shí)，小麥和玉米中的伏馬菌素可完全去除[10]。Tripathi等指出紫外照射可有效地降解AFB1，其降解率隨紫外輻射濃度的變化而不同[11]。本研究以STC為研究對(duì)象，利用不同劑量的60Co-γ射線對(duì)STC進(jìn)行輻射，探索輻照對(duì)溶液中STC是否具有降解作用，從而為食品中STC的去除提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、甲酸、甲酸銨（純度≥98%，質(zhì)譜用）：美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、氯仿（色譜級(jí)）：美國默克公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-30AD）、帶電噴霧離子源三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（LCMS-8050）、XR-ODSⅢC18色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）：日本島津公司；KQ-250DE超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；MS3 basic渦旋儀：德國IKA公司；鈷-60輻照裝置：廣州輻銳高能技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

STC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取2 mg STC標(biāo)準(zhǔn)品溶于200 mL乙腈中，配制成10 mg/L的STC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

STC標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取STC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于容量瓶中，用乙腈梯度稀釋為 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取1 mL的STC標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 的方法條件進(jìn)樣，測(cè)得STC各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，STC濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。在0.1 μg/L～50 μg/L的濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與STC濃度的線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=540 258x+12 392.9，R2=0.999 8。

1.3.3 測(cè)試樣品的制備

不同溶劑樣品制備：將10 mg/L的STC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別用乙腈、水、甲醇和氯仿稀釋至100 μg/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

不同濃度溶液制備：準(zhǔn)確移取10 mg/L的STC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于容量瓶中，分別配制成濃度為50、100、200 μg/L 3種不同濃度的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 γ射線輻照處理及劑量測(cè)定

輻照處理在廣州輻銳高能技術(shù)有限公司進(jìn)行，輻照源為60Co裝置，輻照計(jì)量分別設(shè)定為 0、3、6、9、12、15 kGy，用重鉻酸鉀銀劑量計(jì)跟蹤比對(duì)，測(cè)定樣品的實(shí)際吸收劑量。每一處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.5 STC的測(cè)定方法

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)STC進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱C18（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水+5 mmol/L甲酸銨，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，10%B，1 min～6 min，90%B；6 min～6.1 min，10%B；6.1 min～9 min，10%B；流速0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；以正離子掃描作為掃描方式；以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）作為檢測(cè)方式；離子源接口溫度為300℃；加熱塊溫度為400℃；脫溶劑溫度為250℃；加熱氣流速為10 L/min；干燥氣流速為10 L/min；霧化氣流速為3 L/min；STC的母離子為[M+H]+（m/z 324.6）子離子分別為 310.0（25 eV）和 281.0（36 eV），其中 m/z 310.0 為定量離子。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)樣品檢測(cè)重復(fù)3次，采用Origin8.0對(duì)檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)STC輻照降解效果的影響

不同溶劑對(duì)STC輻照降解影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同溶劑對(duì)柄曲霉素降解率的影響Fig.1 Effect of different solutions on sterigmatocystin degradation rate

由圖1可知，經(jīng)過輻照處理后，4種溶劑中STC的降解效果明顯，并且趨勢(shì)相同，其降解率均隨著輻照劑量的增大而增大。當(dāng)輻照劑量為3 kGy時(shí)，STC的降解速率依次為水＞氯仿＞乙腈＞甲醇，其降解率分別為99.52%、95.60%、84.54%和50.57%。當(dāng)輻射劑量為6 kGy時(shí)，乙腈和水中STC的降解率相近，且均高于氯仿和甲醇。當(dāng)輻射劑量大于6 kGy時(shí)，乙腈、水和氯仿中STC的降解率相近，且甲醇中STC降解率也相對(duì)增加。

2.2 不同起始濃度對(duì)STC輻照降解效果的影響

將 50、100 μg/L 和 200 μg/L 3 個(gè)不同濃度的 STC進(jìn)行輻照處理，研究STC不同濃度對(duì)γ射線輻照降解效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同初始濃度對(duì)柄曲霉素降解率的影響Fig.2 Effect of different initial concentration on sterigmatocystin degradation rate

由圖2中可以看出，當(dāng)輻射劑量為3 kGy和6 kGy時(shí)，STC的初始濃度越低，其降解率越高，即初始濃度為50 μg/L的STC降解率明顯高于濃度為100 μg/L和200 μg/L。當(dāng)輻照劑量高于6 kGy時(shí)，3種不同初始濃度的STC溶液的降解率基本一致，均接近100%。

3 討論

水經(jīng)過輻照后會(huì)產(chǎn)生3種自由基，即還原性極強(qiáng)的H·、氧化性極強(qiáng)的·OH和水合電子e-aq，這3種自由基可加速有機(jī)化合物的降解[12]。本試驗(yàn)中研究了4種不同溶劑中STC的輻照效果，發(fā)現(xiàn)不論輻照劑量大小，水溶液最利于STC的降解[13]。與該研究結(jié)果相類似，李萌萌等研究發(fā)現(xiàn)赤霉病麥粒徑經(jīng)水浸泡后可顯著提高脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）的降解率，當(dāng)劑量為10 kGy時(shí)，其降解率可達(dá)55.76%[14]。其次，毒素的初始濃度和輻照劑量均會(huì)影響毒素降解的效果，當(dāng)輻照劑量一定時(shí)，溶液中水受到輻照所產(chǎn)生的活性自由基數(shù)目一定，因此較低濃度的毒素溶液與水產(chǎn)生的自由基碰撞的幾率高于高濃度的毒素溶液，降解率提高[15]。

真菌毒素最易污染谷物，因此輻照對(duì)谷物中真菌毒素的降解效果以及對(duì)谷物品質(zhì)的影響成為了研究的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)60Co-γ射線可有效降解谷物中的AFB1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A，且輻照后玉米中粗脂肪、粗蛋白含量、水分含量以及粗纖維含量均沒有顯著變化[15-17]。目前多數(shù)研究均發(fā)現(xiàn)輻照處理對(duì)去除食品中真菌毒素效果明顯[18-19]，但是仍有部分研究指出該方法效果不明顯。Jalili等研究了γ射線對(duì)黑胡椒中真菌毒素的降解效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)輻射劑量低于10 kGy時(shí)，樣品中真菌毒素的含量并未降低，作者分析可能是由于胡椒含水量較低所致[20]。1970年，Aibara等報(bào)道輻射劑量高達(dá)182 kGy時(shí)，對(duì)干物質(zhì)中AFB1的降解率并未超過10%[21]。Hooshmand等在研究中也發(fā)現(xiàn)，即使采用20 kGy的γ射線進(jìn)行輻照，小麥、玉米和大豆中的AFB1也并未受到顯著性影響[22]。類似地，用劑量為25 kGy的γ射線對(duì)裝在薄聚乙烯袋中的花生粕進(jìn)行輻照，樣品中AFB1的含量并未出現(xiàn)顯著性降低[23]。

作為AFB1的合成前體物質(zhì)，STC在AFB1含量較高的食品中被頻繁檢出。同時(shí)，STC也是某些真菌的次級(jí)代謝終產(chǎn)物，當(dāng)食品被這類真菌侵染時(shí)，一旦環(huán)境條件適宜，便會(huì)代謝生成有毒STC，威脅人類健康。因此，如何有效控制STC污染以及污染后如何去除成為以后的重點(diǎn)研究方向。

4 結(jié)論

60Co-γ射線可不同程度地降解溶液中的STC，不同輻照劑量對(duì)不同溶劑的降解速率的影響不同，且降解率隨著輻照劑量的增大而增加。當(dāng)輻照劑量為3 kGy時(shí)，水溶液最有利于STC的降解，氯仿次之。當(dāng)輻射劑量大于6 kGy時(shí)，水、乙腈和氯仿中STC的降解率相近，甲醇中STC降解率也相對(duì)增加。在同一輻照劑量下，柄曲霉素的初始濃度越低，其降解率越高。