自組裝原花青素納米復合物的構建及表征

吳雪嬌，吳艷，李旭嬌，郭銳，劉鑫，盛漪

（上海交通大學農業與生物學院上海食品安全工程技術研究中心，上海200240）

原花青素（Proanthocyanidin）是一類含雙黃酮衍生物的天然多酚類化合物的總稱，由兒茶素、表兒茶素和沒食子酸結合而成。原花青素中較多的酚羥基以及其特定的分子立體化學結構、聚體之間的協同作用使其具有極強的抗氧化活性，是一種具有發展前景的化學抗氧化劑的替代品[1]。在醫藥領域，攝入原花青素不僅可以預防氧化應激引起的疾病，如心血管疾病等，還可用于抗潰瘍、抗炎和抗癌[2]。但是，原花青素在應用中存在一定的局限性，主要包括以下幾個方面：1）不適宜的風味（苦澀味）；2）對環境條件（酸堿度、氧氣、溫度和光）敏感[3-4]；3）酚羥基結構易于氧化；4）生物利用度低，半衰期短[5]。

納米載體系統可以用來提高原花青素的生物利用度，起到保護及靶向運輸的作用[6-7]，充分發揮原花青素的抗氧化活性。自組裝技術是指在平衡條件下，兩親性聚合物通過非共價鍵作用，自發締結成熱力學穩定、具有核殼結構的納米粒的過程，它具有操作簡便，不需要使用有機溶劑的優勢。為了可以口服使用并盡量減少載體誘導的不良細胞毒性，食品級大分子是生物聚合物的最佳選擇，它們不僅具有生物降解性和生物相容性，而且還可以發揮特殊的生物功能。

酪蛋白是牛奶中的一種伸展性蛋白，其獨特的伸展結構能夠平衡高凈電荷和低內疏水性，與多酚的結合力強。但是酪蛋白在水中溶解性較低，酪蛋白-多糖自組裝接枝物與其構造單元相比，具有更好的兩親性和表面活性作用[8]，可以抑制由于高濃度或與多酚相互作用而導致的相應蛋白的沉淀，在多酚的包埋研究中發揮有獨特的優勢。

目前，有關包埋水溶性物質的納米顆粒制備的研究較少[9]。本文利用糖接枝的酪蛋白與原花青素進行結合，構建了一種納米復合物。以接枝度、褐變度和蛋白溶解度為指標，對酪蛋白和麥芽糊精自組裝后的產物的物化性質進行評價，并通過紅外光譜和圓二色譜從微觀上分析蛋白和多糖之間結合的機制。以包埋率為指標選擇最優的原花青素納米復合物的構建工藝，并對其進行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、硼酸鈉：上海泰坦科技股份有限公司；麥芽糊精、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、原花青素：上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）：薩恩化學技術（上海）有限公司；考馬斯亮藍G250：國藥集團化學試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速離心機（H2050R-1）：湘儀離心機儀器有限公司；冷凍干燥機（BILON2000F）：上海比朗儀器制造有限公司；電子天平（PL 203）、pH 計（FE20）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；納米粒度-Zeta電位儀（NanoBrook Omni）：美國布魯克海文儀器公司；紫外分光光度計（UV-1810）：北京普析通用儀器有限責任公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 6700）：蘇州佐藤精密儀器有限公司；圓二色譜儀（J815）：日本JASOC公司；高分辨場發射掃描電子顯微鏡（Sirion 200）：美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的制備

稱取質量比1∶2的酪蛋白和麥芽糊精，酪蛋白濃度為10 mg/mL，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解，磁力攪拌器攪拌均勻，25℃下水合24 h后，冷凍干燥。將凍干物碾碎，過80目篩，用帶孔的錫箔紙封好。在相對濕度79%、溫度60℃的條件下，使其在恒溫恒濕箱中反應不同時間，得到自組裝接枝物，存放于4℃下備用。

1.3.2 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的物化性質研究

1.3.2.1 接枝度

蛋白與多糖的自組裝通過蛋白的ε-氨基和多糖的還原端羰基之間的共價偶聯反應進行[10]，因此以氨基數目計算接枝度表示反應進行的程度。

OPA法[11]：OPA試劑為將40mg的OPA溶解于1mL甲醇中，加入2.5 mL0.2 g/mL SDS，25 mL 0.1 mol/L硼酸鈉及100 μL β-巰基乙醇，用去離子水定容至50 mL。測定時，取4 mL OPA試劑于試管中，加入樣品液200 μL，混勻后于40℃反應2 min，在340 nm下測定其吸光值At。在OPA溶液中加入200 μL去離子水代替樣品液作為空白對照A0。

接枝度計算公式：

式中：A0為未反應時樣品的吸光度；At為反應t時刻樣品的吸光度。

1.3.2.2 褐變度

取酪蛋白-麥芽糊精反應產物，用去離子水溶解，配制為濃度10 mg/mL的均勻溶液，以去離子水作為空白對照，在420 nm處測定不同反應時間下的吸光值，以吸光度的大小反應其褐變程度。

1.3.2.3 蛋白溶解度

將接枝物溶解于不同pH值的磷酸鹽緩沖液中，調節pH值由3.0～7.0，10 000 r/min的轉速下離心10 min（4℃）。用考馬斯亮藍法測定上清液中溶解的蛋白質含量。

蛋白質溶解度的計算公式[12]：

1.3.3 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的表征

1.3.3.1 傅里葉-紅外光譜分析

分別稱取酪蛋白、麥芽糊精及接枝物適量（2 mg），以質量比1∶50的量加入一定量的溴化鉀，待樣品和溴化鉀充分混合均勻后，壓成薄片，在400 cm-1～4 000 cm-1的波數范圍掃描。

1.3.3.2 圓二色譜分析

將接枝物溶于去離子水中，調節蛋白質濃度為0.1 mg/mL，在25℃下使用圓二色譜儀掃描分析蛋白質樣品二級結構的構象變化。掃描波長190 nm～250 nm，樣品池光程為10 mm，掃描速率100 nm/min，掃描步長1.0 nm。每個樣品掃描3次，對光譜解析后計算蛋白二級結構的含量[13]。

1.3.4 原花青素納米復合物的制備

將一定量的原花青素溶于去離子水中，攪拌至全部溶解。將酪蛋白-麥芽糊精接枝物溶解于磷酸鹽緩沖液中，將原花青素溶液緩慢倒入接枝物混合溶液中，在常溫下攪拌均勻，-18℃下冷凍過夜后冷凍干燥，獲得納米復合物。

1.3.5 原花青素納米復合物構建過程中單因素優化

1.3.5.1 芯壁比

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質量比1∶2，接枝時間15 h）濃度為10 mg/mL，磷酸鹽緩沖液pH 7.0，原花青素/接枝物的質量比分別為1∶10、2 ∶10、3 ∶10、4 ∶10和 5 ∶10。

1.3.5.2 接枝物濃度

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質量比 1 ∶2，接枝時間 15 h）濃度分別為 2.5、5、10、25、50 mg/mL，磷酸鹽緩沖液 pH 7.0，原花青素/接枝物的質量比為2∶5。

1.3.5.3 接枝反應時間

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質量比 1 ∶2，接枝時間分別為 0、5、10、15、20、25 h）濃度為10 mg/mL，磷酸鹽緩沖液pH 7.0，原花青素/接枝物的質量比為2∶5。

1.3.5.4 環境pH值

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質量比為1∶2，接枝時間15 h）濃度為10 mg/mL，磷酸鹽緩沖液 pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0，原花青素/接枝物的質量比為2∶5。

納米復合物表面原花青素的測定：取1 g樣品加入45 mL無水乙醇，洗滌5 min后過濾，濾液移入50 mL容量瓶中，加入5 mL蒸餾水，用無水乙醇定容。取樣液0.5 mL，加入具塞試管，然后加入5 mL正丁醇-鹽酸（95∶5，體積比）溶液，封口，在90℃水浴中加熱2 h，于546 nm處測定吸光值。

納米復合物中總原花青素的測定：取1 g樣品放入研缽中，加5 mL蒸餾水研磨破壁，加入45 mL無水乙醇過濾，濾液移入50 mL容量瓶，用無水乙醇定容。取樣液0.5 mL，加入具塞試管，然后加入5 mL正丁醇-鹽酸（95∶5，體積比）溶液，封口，在90℃水浴中加熱2 h，于546 nm處測定吸光值。

1.3.6 粒徑及電位分析

選擇配有He/Ne激光器（λ=633 nm）的Nano-Zs90馬爾文粒徑分析儀，散射角為90°。將待測樣品裝入聚苯乙烯比色皿中（折光指數1.33），測定溫度25℃，保溫3 min，記錄納米復合物的平均粒徑和多分散指數。采用Zeta-Nano分析儀對納米復合物的表面帶電情況進行測量。

1.3.7 掃描電鏡觀察

將少量待檢測微粒涂抹于導電膠上，使用離子噴鍍儀噴金，噴金電流15 mA，噴鍍時間60 s，于10 kV電壓下觀察樣品。

1.4 數據處理

使用軟件SPSS處理數據，試驗結果重復3次取平均值，計算標準差（S.D.）。使用軟件Graphpad prism繪圖。

2 結果與分析

2.1 自組裝接枝度的測定

蛋白與多糖自組裝所得兩親性生物聚合物的性質受到多種因素影響。其中，接枝度直接反映了蛋白的糖基化程度，是接枝物最重要的理化性質之一[14]。

Turan等[15]研究發現，乳清分離蛋白與葡聚糖的最佳接枝比為1∶3；Cheng等[16]試驗證明，當大米蛋白與葡聚糖的質量比達到2∶1時，其接枝度最大，為22.98%。這表明，特定的蛋白質和糖分子之間存在最適宜的質量比使得其接枝度達到最大，適當的質量比既能增加反應的速率，又能降低不期望反應的發生。通過預試驗，本試驗選定酪蛋白/麥芽糊精的質量比為1∶2。本試驗研究了反應時間對自組裝所得接枝物的接枝度的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同反應時間下接枝度的變化Fig.1 Changes of grafting degree under different reaction time

由圖1可知，反應時間延長，接枝度隨之增加，25 h時，接枝度最大，為（50.16±0.90）%。反應時間到達15 h后，接枝度變化不大（p＞0.05）。在此反應過程中，接枝度增長率的變化可能是因為在不同反應階段形成了不同的產物，不同產物的形成所需要的反應時間和反應物的濃度等因素有關，所以會導致接枝度的變化率的改變。Li等[12]利用D-葡萄糖、黃原膠與大豆分離蛋白結合發現，隨著反應時間由6 h增加到24 h，其糖基化程度有所降低。導致這種不期望結果的原因可能是隨著反應時間的延長，蛋白質之間的相互作用增加，與D-葡萄糖、黃原膠共同競爭和大豆分離蛋白之間的結合位點，從而導致接枝度的降低[10]。所以，需要合理控制反應的時間。

2.2 不同反應時間下褐變度的變化

酪蛋白與麥芽糊精的自組裝反應也是一種蛋白與多糖之間的干法美拉德反應。隨著反應的進行，酪蛋白-麥芽糊精接枝產物會發生褐變現象。美拉德濕法反應一般較為徹底，褐變程度較嚴重，褐變指數最小一般在0.2左右，在反應后期，會產生棕褐色物質，即類黑精，而干法美拉德反應的褐變程度較低。

不同反應時間下，接枝物褐變程度的變化見圖2，不同反應時間下產物顏色的變化見圖3。

圖2中，美拉德反應時間在0～25 h之間時，褐變指數基本維持在0.25左右。圖3可以直觀的發現，產物的顏色呈現淡黃色。黃色可能是由于多糖的熱分解脫水（焦糖化）造成的[17]。麥芽糊精因為在葡萄糖C-4碳原子處具有羥基殘基，所以不容易發生Amadori反應，使得其美拉德反應能夠控制在初級階段，可以很好的控制美拉德產物的顏色，并防止后期有害大分子的生成，適合于食品工業的應用。

圖2 不同反應時間下褐變度的變化Fig.2 Changes of browning degree under different reaction time

圖3 不同反應時間下產物顏色的變化Fig.3 Change of product color under different reaction time

2.3 自組裝反應對接枝物溶解度的影響

溶解性是蛋白的一個重要屬性，它可以影響蛋白的乳化性和凝膠性等其它特性。天然酪蛋白在其等電點附近凈電荷約為零，蛋白易沉淀。糖接枝蛋白自組裝反應對接枝物溶解度的影響見圖4。

圖4 糖接枝蛋白自組裝反應對接枝物溶解度的影響Fig.4 Effect of self-assembly of glycoprotein on solubility of graft copolymer

圖4顯示，當酪蛋白與麥芽糊精進行自組裝反應后，其溶解度顯著提高。這是因為在自組裝產物中，酪蛋白和麥芽糊精通過次級力形成較弱的復合物，暴露了更多的親水基團，有利于蛋白的溶解。Jiménez-Casta?o等[18]研究發現，蛋白質-多糖結合物比蛋白質本身具有更多的親水性基團，與親水性多糖結合可提高蛋白質與水分子的親和力，并在不利條件下限制蛋白質的相互作用。隨著反應的進行，后期可能會產生不溶性的聚合物，同時會發生蛋白質的交聯反應，這些因素阻礙了接枝反應的進行，使得其溶解度不再變化或變化不明顯（p＜0.05）。

2.4 傅里葉-紅外光譜分析

測定蛋白、多糖及其接枝物的紅外光譜圖，分析其官能團的特征吸收峰的變化。其中，酪蛋白的傅里葉-紅外光譜圖見圖5。

圖5 酪蛋白傅里葉-紅外光譜圖Fig.5 Fourier-infrared spectra of casein

圖5酪蛋白的特征譜中，顯示出較強的酰胺I、II、III帶，它們大致位于波數1 630 cm-1～1 680 cm-1、1 530 cm-1～1 560 cm-1、1 260 cm-1～1 420 cm-1之間[19]。酰胺 I帶是由肽鍵的C＝O伸縮振動引起，酰胺II帶是C-N伸縮振動以及N-H彎曲[20]。1 540 cm-1處的吸收峰是由酰胺II帶的-NH拉伸振動引起。1 400 cm-1處的吸收峰是酰胺III帶的C-N振動。1 250 cm-1的吸收峰屬于肽鍵的C-H拉伸振動。

麥芽糊精的傅里葉-紅外光譜圖見圖6。

圖6 麥芽糊精傅里葉-紅外光譜圖Fig.6 Fourier-infrared spectra of maltodextrin

在圖6麥芽糊精的紅外光譜圖中，波數為1180 cm-1～953 cm-1的一系列重疊峰是由C-C、C-O、C-O-C的伸縮振動和C-H的彎曲引起的[20]。

酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的傅里葉-紅外光譜圖見圖7。

圖7 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物傅里葉-紅外光譜圖Fig.7 Fourier-infrared spectra of casein-maltodextrin selfassembled grafts

在圖7酪蛋白-麥芽糊精接枝物的紅外光譜中，1 500 cm-1～1 700 cm-1左右的吸收峰主要是由酰胺I和II帶的C＝O伸縮振動、C-N伸縮振動提供。通過自組裝反應后，1 500 cm-1～1 600 cm-1左右的吸收峰與酪蛋白相比明顯減弱，表明氨基數目減少。其次，1 000 cm-1～1 200 cm-1的吸收峰與麥芽糊精相比，發生偏移，表明酪蛋白和麥芽糊精反應生成了新的官能團[21]。

2.5 圓二色譜分析

對酪蛋白以及反應后的蛋白接枝物進行圓二色譜分析可以得到其在接枝過程中蛋白質發生的結構變化，結果見表1。

表1 酪蛋白及其接枝物的蛋白二級結構分析Table 1 Protein secondary structure analysis of casein and its graft %

由表1可知，當酪蛋白與麥芽糊精進行自組裝后，其α-螺旋、β-折疊、β-轉角都有所減少，無規則卷曲結構增加。這是因為蛋白質的α-螺旋、β-折疊一般埋在多肽鏈的內部，加熱以及大分子之間的相互作用使得酪蛋白的分子結構發生了變化。反應后無規則卷曲結構的增加有利于分子間氫鍵的形成和疏水氨基酸殘基的暴露。這與Feng等[22]使用美拉德反應制備大豆分離蛋白-麥芽糊精接枝物和大豆分離蛋白-阿拉伯膠接枝物測出的接枝物的圓二色譜結果類似。但是略有不同的是，其試驗發現，大豆分離蛋白-麥芽糊精接枝物的無規則卷曲率大于其混合物的無規則卷曲率，而本試驗中，酪蛋白-麥芽糊精接枝物的無規則卷曲的比例與其混合物相比，略有減少，造成這種現象的原因可能是當酪蛋白和麥芽糊精發生接枝反應后，雖然部分酪蛋白的肽鏈被打開，其結構得到伸展，但是由于酪蛋白的氨基與多糖的羰基相結合，使得其二級結構變得更穩定，所以本試驗獲得其無規則卷曲的比例略微減小的結果。

2.6 反應參數對原花青素包埋率的影響

2.6.1 芯壁比對包埋率的影響

根據試驗得到的不同芯壁比對包埋率的影響見圖8。

圖8 芯壁比對包埋率的影響Fig.8 Effect of core-wall ratio on encapsulation efficiency

圖8顯示，當原花青素的濃度較低時，麥芽糊精對酪蛋白存在空間位阻效應[23]，阻礙了原花青素與蛋白的接觸，包埋率較低。隨著芯壁比的增加，可以與酪蛋白-麥芽糊精接枝物結合的原花青素增加，其包埋率也隨之增加。當原花青素的濃度較大時，多余的原花青素不能完全被糖基化酪蛋白結合，暴露在納米顆粒表面，導致包埋率的降低。Liu等[24]使用殼聚糖/磺丁基-β-環糊精包埋茶多酚發現，當茶多酚的濃度由1 mg/mL增加到3 mg/mL時，其包埋率減小，這主要是因為隨著茶多酚質量比的增加，殼聚糖/磺丁基-β-環糊精的基質達到飽和，導致多余的茶多酚附著在其表面或游離于溶液中，所以包埋率減小。

2.6.2 接枝物濃度對包埋率的影響

根據試驗結果得到接枝物濃度對包埋率的影響見圖9。

圖9 接枝物濃度對包埋率的影響Fig.9 Effect of graft concentration on encapsulation efficiency

圖9顯示，隨著接枝物濃度的增加（2.5 mg/mL～25 mg/mL），對原花青素的包埋率也隨之增加。這是因為隨著接枝物濃度的提高，更多的接枝物可以與原花青素之間通過疏水相互作用、氫鍵作用自組裝形成納米粒子。此外，由于多糖分子的存在，會形成一定的空間位阻，使得酪蛋白的分子結構更加分散，接觸面積有所增加，促使其更容易與原花青素進行結合[25]。當可以與原花青素進行反應的接枝物的數量達到最大值后，接枝物濃度進一步增大（25 mg/mL～50 mg/mL），蛋白分子之間易發生相互作用，形成聚集體，從而使得酪蛋白-麥芽糊精接枝物與原花青素之間的結合受阻，包埋率降低。

2.6.3 接枝時間對包埋率的影響

圖10反應了接枝時間對包埋率的影響。

圖10 接枝反應時間對包埋率的影響Fig.10 Effect of grafting reaction time on encapsulation efficiency

由圖10可知，隨著反應的進行，麥芽糊精和酪蛋白之間逐漸形成穩定的核殼結構，能夠更好地包埋原花青素，其包埋率得以增加。但是，隨著反應時間的進一步延長，反應后期會生成一些不期望的物質，一方面，這些物質可能易分解、不穩定，從而導致更多的原花青素分散在接枝物的表面，其包埋率降低；另一方面，某些聚合物的生成會使得酪蛋白-麥芽糊精對原花青素的結合作用受到阻滯，導致包埋率的降低。

2.6.4 環境pH值對包埋率的影響

原花青素作為一種多酚化合物，對環境pH值較敏感，此外，溶液pH值對酪蛋白的溶解度也具有一定影響。環境pH值對包埋率的影響見圖11。

圖11 環境pH值對包埋率的影響Fig.11 Effect of environmental pH on encapsulation efficiency

由圖11可以看出，當酪蛋白自組裝產物的溶液pH值控制在6～8之間時，其包埋率基本穩定不變。酪蛋白的等電點為pH 4.6左右，當溶液pH值在其等電點附近時，酪蛋白的溶解度較低，這時它表現為電中性，導致接枝物對原花青素的包埋率也較低。Pulicharla等[26]采用草莓多酚和殼聚糖反應結合，發現在pH4.0時，殼聚糖中的羥基呈現出對草莓多酚排斥的負電荷，因此，水溶性的草莓多酚和殼聚糖之間的相互作用減弱，包埋率降低。當進入堿性環境后，蛋白分子多以無規則線團形式存在，使得其與多酚之間能形成穩定的納米粒子[27]，包埋率也因之較為穩定。當環境pH值達到6.0后，其對包埋率影響不顯著（p＞0.05），所以，后續試驗選擇pH 7.0作為環境pH值。

2.7 正交優化

根據單因素試驗的結果，選擇芯壁比、接枝時間、接枝物濃度作為變量，如表2所示設計三因素三水平的正交試驗對制備條件進行優化。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels graph

正交試驗結果如表3所示。

表3 正交優化試驗Table 3 Orthogonal optimization test

續表3 正交優化試驗Continue table 3 Orthogonal optimization test

由表3可知，此三因素對包埋率的影響顯著程度為：芯壁比＞接枝時間＞接枝物濃度。K值最佳的包埋條件為：芯壁質量比2∶5，接枝時間15 h，接枝物濃度25 mg/mL。對理論最佳制備參數A2B2C3進行3次平行驗證試驗得出，在此條件下制備得到的原花青素包埋率為93.48%，大于正交試驗的最大包埋率93.17%，說明最佳制備參數A2B2C3確為最優。

2.8 原花青素納米復合物的表征

本試驗構建獲得原花青素納米復合物的平均粒徑為（158.69±1.70）nm，PDI為 0.189±0.005，Zeta電位為（-30.58±1.27）mV，包埋率為（93.48±0.20）%。酪蛋白-麥芽糊精原花青素納米復合物的粒徑分布見圖12。

圖12 酪蛋白-麥芽糊精原花青素納米復合物的粒徑分布Fig.12 Particle size distribution of casein-maltodextrin proanthocyanidin nanocomposites

圖12顯示了原花青素納米復合物的粒徑分布情況，可以看到其粒徑主要集中在200 nm左右，分布較均勻。Liu等[24]分別將酪蛋白與原花青素溶于去離子水中，小麥醇溶蛋白和原花青素溶于乙醇溶液中，制備得到兩種納米復合物。當選定蛋白與原花青素的質量比為1∶0.5時，酪蛋白-原花青素納米復合物的粒徑為140 nm，而小麥醇溶蛋白-原花青素納米復合物的粒徑為212 nm，其包埋率分別約為55%和45%，Zeta電位分別約為-15 mV和-10 mV。Yin等[28]采用逆向蒸發法和超聲處理相結合，將大豆卵磷脂-膽固醇與原花青素結合制備成納米脂質體，其最高包埋率為（71.97±0.42）%。Tie等[29]以原花青素為芯材，以阿拉伯膠和β-環糊精為壁材，采用高壓微射流技術結合噴霧干燥制備得到原花青素乳液及其微膠囊，其包埋率為（88.60±0.3）%，在最佳條件下制備得到微膠囊的Zeta電位為（12.13±0.12）mV。相比而言，本試驗構建的原花青素納米復合物的包埋率和Zeta電位的絕對值都顯著較大。由結果可知，蛋白/多糖的結合與其構成物相比，能夠顯著提高原花青素的包埋率，這主要是因為酪蛋白與麥芽糊精接枝使得納米復合物中形成一定的空間位阻，增加了原花青素與自組裝接枝物的結合位點，此外，親水的多糖鏈可以通過氫鍵等作用力與水分子進行結合構成外殼結構，酪蛋白的疏水基團可以通過疏水相互作用形成疏水微區，進一步包埋原花青素，從而提高其包埋率。納米顆粒的穩定性依賴于納米顆粒相互靠近時其間排斥力和吸引力的平衡。Zeta電位絕對值越高，即排斥力大于吸引力，體系越穩定。所以本試驗構建的納米復合物具有更好的穩定性。

2.9 原花青素納米復合物的掃描電鏡分析

對酪蛋白-麥芽糊精接枝物及原花青素納米復合物的表觀形態利用掃描電鏡進行觀察，可以發現結果如圖13和圖14所示。

圖14 酪蛋白-麥芽糊精原花青素納米復合物的掃描電鏡圖Fig.14 Scanning electron microscopy of casein-maltodextrin proanthocyanidin nanocomposites

從圖13和圖14中可以發現酪蛋白-麥芽糊精反應接枝物形成了具有小孔、裂縫和褶皺的片狀物，這可能是由于冷凍干燥使得其表面及內部水分蒸發，形成多孔的結構。而原花青素納米復合物則呈現一種有規律的具有光滑表面的緊湊的球狀結構。這是因為原花青素能填滿基質的空腔，導致多孔性降低，使得其表面也更加光滑[30]。

3 結論

本文主要研究酪蛋白與麥芽糊精自組裝反應中的理化性質及作用機制，并確定原花青素和酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物形成納米復合物的最佳條件，以包埋率為指標，優化納米復合物形成過程中的條件。確定構建的最佳工藝參數：酪蛋白/麥芽糊精質量比1∶2；接枝反應時間15 h；原花青素/接枝物質量比2∶5；接枝物濃度25 mg/mL；溶液pH 7.0。在最佳工藝條件下，其包埋率達到93.48%，平均粒徑為158.69 nm，Zeta電位為-30.58 mV，所得納米復合物呈現光滑緊湊的球狀結構。綜上，本試驗通過將蛋白與多糖自組裝形成的兩親性生物聚合物與原花青素結合構建了一種穩定的納米復合物，為生物活性化合物的載運開辟了一條新途徑，其在功能性食品和藥品的應用中具有廣闊的發展前景。