一株鴨源大腸桿菌的分離、鑒定和耐藥性分析

許佳蒞

摘 要：以嘉興海寧地區鴨場送檢的4份病料（腦組織、肝臟、脾臟等）為材料，通過增菌及分離培養獲得疑似大腸桿菌1株;進一步通過革蘭氏染色鏡檢及PCR檢測，鑒定陽性1株;對分離得到的菌株進行藥敏試驗，結果顯示，分離菌株對慶大霉素、丁胺卡那2種藥物高度敏感。

關鍵詞：鴨源大腸桿菌;分離鑒定;耐藥性

中圖分類號 S852.61+2文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）15-0099-03

大腸桿菌是目前對養鴨業危害最為嚴重的高致病性細菌之一，其血清型眾多且分布廣泛。各養殖場通常使用抗生素來預防和治療大腸桿菌病，但長期大量不合理的使用導致大腸桿菌耐藥頻譜不斷擴大，甚至有些菌株已面臨無藥可用的現狀。因此，有必要根據不同地區甚至相同地區不同養殖場的大腸桿菌流行現狀，規范、合理使用抗生素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 送檢的疑似病例來自海寧地區的養鴨場，經過無菌操作采集病死鴨的腦、肝臟及心臟等器官備用。

1.1.2 培養基和試劑 麥康凱培養基（MacC）、LB液體培養基、生化鑒定管均購自上海博微生物科技有限公司，DNA Marker DL 2000、10×Loading buffer為大連寶生（Takara）生物工程公司產品，Gel Red核酸染料購自上海生工生物科技有限公司，50×TAE電泳緩沖液購自上海碧云天生物科技有限公司，引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 藥敏試紙 試驗使用的抗生素藥敏試紙（共包含10種抗生素，為氯霉素、復方新諾明、頭孢唑啉、諾氟沙星、紅霉素、慶大霉素、丁胺卡那、環丙沙星、氨芐青霉素、青霉素）購自杭州微生物試劑有限公司，Premix Taq酶訂購于寶生生物技術（北京）有限公司。香柏油為上海懿洋儀器有限公司生產，革蘭氏染色液購自杭州微生物試劑有限公司，抗菌藥物藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離純化 無菌操作采集病死鴨的腦、肝臟以及心包液等器官，將其接種在新制的麥康凱平板上，置于恒溫振蕩培養箱中于37℃有氧培養24h。觀察細菌的生長情況，并挑取疑似大腸桿菌的單菌落于麥康凱平板上進行劃線培養，置于恒溫培養箱中37℃培養24～48h。觀察平板中細菌生長情況，可見到針尖大小、紫紅色菌落，再挑取單個菌落作進一步純化培養。純培養物進行MacC平板劃板純化，37℃培養24～48h作初步鑒定。挑選疑似大腸桿菌的純菌落接種于LB液體培養基上，放入恒溫振蕩培養箱中于37℃培養24h，觀察菌液并與麥氏標準比濁管比濁，確定渾濁度以確定細菌活性。此菌液用于PCR鑒定。

1.2.2 革蘭氏染色 選取于4℃冰箱中生長旺盛的平板，使用潔凈接種環于平板中挑取明顯菌落中大腸桿菌進行革蘭氏染色。首先于載玻片上滴1滴無菌水，將環上菌體于水中攪拌數次，然后在酒精燈火焰上方通過5～6次以殺滅菌體并將水分蒸干。液體蒸干后滴加結晶紫染料，1min后將玻片傾斜45°用純凈水沖洗干凈多余染料，并用濾紙吸干多余水分。滴加碘溶液至玻片中心，靜置1min，用純凈水沖洗并用濾紙吸干多余水分，然后用95%乙醇溶劑進行脫色漂洗。下襯白紙，待無有色液體洗出后停止加入乙醇，并用無菌水洗去過量的乙醇溶劑，然后用純凈水沖洗干凈。使用番紅染色劑染色2min后用純凈水沖凈并吸干多余水分。如此重復6次得到大腸桿菌的革蘭氏染色片。

1.2.3 生化試驗 將純化的菌株接種到腸桿菌科細菌生化鑒定管，37℃培養24h。

1.2.4 PCR檢測 （1）引物的設計與合成：根據GenBank中大腸桿菌外膜蛋白A編碼序列的保守區域設計特異性引物，引物序列設計見表1。（2）反應體系的配置：以上述步驟獲得的菌液作為模板進行菌液PCR檢測，按照使用說明配制PCR反應體系。（3）反應程序設置：PCR反應體系設定完成后，按照表2中程序設定PCR儀程序。（4）凝膠電泳成像：以提取的大腸桿菌質粒DNA為模板，擴增大腸桿菌基因，并通過凝膠電泳檢測。首先觀察電泳槽的水平情況，通過調節腳墊旋鈕將電泳槽置于水平面上。此后在30mL 1×TAE電泳緩沖液中稱取0.24g瓊脂糖，將瓊脂糖顆粒在微波爐中完全溶解，冷卻至50℃時加入10×上樣緩沖液，混合并倒入橡膠板中并放置梳子，凝固后除去。然后將PCR反應產物與溴酚藍混合并依次加到固化的凝膠孔中。在PCR反應結束后，設定120V、100mA于1×TAE電泳緩沖液中電泳，膠體右側滴加marker。最后將電泳檢測擴增條帶置于凝膠成像系統中成像并記錄。

1.2.5 藥敏試驗 吸取搖床37℃培養的液體培養基中菌液于麥康凱培養基中涂覆3次，每次旋轉60°，最后涂覆一周以確保足夠均勻。37℃培養12h，用生理鹽水稀釋至與麥氏標準比濁管濁度相同的濃度，然后置于瓊脂平板上晾干后倒置保存。用鑷子蘸取95%乙醇并通過火焰，待燒干后再蘸取乙醇重復上述操作3次。待冷卻后，用此無菌鑷子夾取不同藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區域，兩紙片間距不小于24mm，紙片距平板邊緣不小于15mm。將藥物敏感試紙置于培養基表面并壓緊。每只平板等間距放置5張藥敏試紙。于37℃恒溫箱培養24h觀察結果。最后，參照CLSI藥敏性試驗標準中關于桿菌科的標準，在保證試驗結果無明顯誤差的情況下，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，獲得分離菌敏感性試驗結果。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定及鏡檢結果 所得的菌株在37℃劃線上的麥康凱板并培養20h。MacC瓊脂上可以看到紫紅色干菌落，形狀具有倒圓的起伏，表面平整、濕潤，邊緣圓滑，直徑3mm左右，為典型的大腸桿菌菌落特性。挑取典型菌落接種于培養基上純化培養。從培養基中挑取菌體加入新制成的LB液體培養基中，蓋上硅膠塞后置于搖床上160r/min、37℃振蕩培養24h。次日觀察菌種均在LB液體培養基中正常生長呈渾濁狀態，且試管底部出現絮狀沉淀。在100×10倍油鏡下觀察：所提取菌種為革蘭陰性G-，鏡中菌體成短小鈍頭細桿狀，單個生長或成對出現，未發現芽孢或莢膜。

2.2 生化試驗結果 該細菌能夠發酵甘露醇、葡萄糖、乳糖和麥芽糖，產酸產氣;發酵蔗糖，不產氣;MR試驗、吲哚試驗陽性;硫化氫試驗、VP試驗、檸檬酸鹽利用試驗和尿素酶試驗為陰性。生化試驗結果符合大腸桿菌的生化特性。

2.3 PCR鑒定 按上述PCR反應條件和程序設定，對提取到的菌體進行PCR后與上樣緩沖液混合，將其滴入電泳凝膠孔洞中，最右側孔道中滴加Marker。設定電泳儀120V、100mA，于1×TAE電泳緩沖液中進行電泳20min，將電泳凝膠置于熒光成像系統中觀察，菌體出現大小與濃度接近的250bp目的基因片段（見圖1），因此PCR結果確定菌體為大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結果 根據美國臨床實驗室標準化協會的相關標準，獲得大腸桿菌敏感性試驗結果（表3）：分離菌對慶大霉素、丁胺卡那2種藥物高度敏感;對其他8種藥物低敏感度或不敏感。

3 結論與討論

鴨大腸桿菌病感染鴨后可引發氣囊炎、關節炎、腹膜炎、心包炎等疾病，嚴重影響禽畜類生長和發育，甚至導致死亡，尤其在大規模養殖企業頻發，導致經濟效益下降。在本地鴨群飼養過程中，鴨大腸桿菌病與其他病菌交叉感染并相互影響，病癥出現多發性的特異性，給防范和防治帶來較大困難。本試驗篩選出對該養殖場大腸桿菌高度敏感的2種藥物慶大霉素和丁胺卡那，能夠預防和治療大腸桿菌病。

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（責編：徐世紅）