寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)植株再生體系的建立

黃麗燕 顧安樂 周玉麗

摘 要：選用寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)作為外植體進行離體再生，研究外植體消毒時間、不同激素濃度對大豆子葉節(jié)再生的影響。結(jié)果表明：寧鎮(zhèn)1號大豆用0.1% HgCl2消毒最適時間為12～16min，不定芽誘導(dǎo)最適的6-BA和TDZ濃度分別為2.0mg/L和0.1mg/L，最適的6-BA和TDZ組合濃度為6-BA 1.00mg/L和TDZ 0.05mg/L，最適合生根的IBA濃度為0.4mg/L。

關(guān)鍵詞：大豆種子;子葉節(jié);不定芽;再生體系

中圖分類號 S565.1文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）15-0021-03

Abstracts： Ningzhen NO.1 soybean was used as explant for regeneration and the effect of different disinfection time and different concentrations of hormone on the cotyledon node regeneration of soybean were studied. The results showed that the most suitable time of disinfection by 0.1% HgCl2 is between 12 to 16 minutes， and the most suitable concentration of 6-BA and TDZ for regenerating adventitious shoots is 2.0mg/L and 0.1mg/L， the concentration of the combination of the two is 6-BA 1mg/L and TDZ 0.05mg/L， and the best concentration of IBA for rooting is 0.4mg/L.

Key words： Soybean seed; Cotyledonary node; Adventitious bud; Regeneration system

大豆是重要的油料及糧食作物，是食用油和植物蛋白的主要來源之一。將優(yōu)良外源基因?qū)氪蠖怪袑窈蟮拇蠖褂N和加工生產(chǎn)起到積極的推動作用，并能有效提升大豆的營養(yǎng)和經(jīng)濟利用價值[1]。但是大豆轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵問題就是遺傳轉(zhuǎn)化效率極低，只有0.3%～0.9%，而且受基因型影響較大。

建立高效穩(wěn)定的大豆再生體系是大豆遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件[1]。至今人們已從大豆子葉[2]、子葉節(jié)[3]、胚尖[4]、上胚軸[5]、莖尖[6]、未成熟種子的子葉[7]及莖尖[8]等方面對不定芽器官發(fā)生再生系統(tǒng)進行了研究，發(fā)現(xiàn)子葉節(jié)具有取材不受季節(jié)限制、誘導(dǎo)率高、成苗快、變異風(fēng)險較低、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點[9]，被認(rèn)為是目前用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化較為理想的外植體[10-11]。

本試驗以項目組現(xiàn)篩選出的寧鎮(zhèn)1號大豆品種為材料，從種子消毒、不定芽誘導(dǎo)、不定芽生根等方面對寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)植株再生體系的建立進行了初步研究，旨在為建立大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料 大豆品種：寧鎮(zhèn)1號。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 挑選籽粒飽滿且無病蟲害的寧鎮(zhèn)1號大豆種子，先用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺中操作以下步驟：用75%的乙醇消毒30s，無菌水沖洗2～3次，再在0.1%的升汞溶液中浸泡消毒，升汞消毒時間分別為0、2、4、8、12、16min，用無菌水沖洗3～4次。將消毒后的種子種臍向下接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個消毒時間處理接種20瓶。在26℃、每日光照16h的條件下培養(yǎng)，5d后記錄并清理污染瓶數(shù)。種子萌發(fā)培養(yǎng)基采用1/2MS B5（MS培養(yǎng)基大量元素減半，有機成分為B5）+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo) 在大豆種子萌發(fā)、長出子葉且子葉尚未展開時取出，去除種皮，將子葉橫向切去1/2，保留3～5mm下胚軸，再縱切分離2片子葉，切除頂芽、葉腋以及子葉邊緣一部分，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。不定芽誘導(dǎo)采用2種處理的培養(yǎng)基，均以1/2MS B5為基本培養(yǎng)基，一種是6-BA和TDZ單獨作為培養(yǎng)基，共設(shè)7個濃度，每個濃度條件下接種11瓶，每瓶5個外植體;另一種是6-BA和TDZ組合作培養(yǎng)基，共設(shè)12個濃度，每個濃度條件下接種7瓶，每瓶5個外植體（見表2）。定時清理污染瓶，接種21d后統(tǒng)計不定芽數(shù)量。不定芽誘導(dǎo)率指發(fā)生不定芽的外植體占接種未污染的外植體總數(shù)的百分比。

1.2.3 不定芽的伸長 接種28d后，將外植體上的不定芽切下并轉(zhuǎn)移至不定芽伸長培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。采用1/2MS B5+0.5mg/L 6-BA+0.05m/L IBA+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L作為不定芽伸長培養(yǎng)基。

1.2.4 生根 將長至2～3cm的不定芽接種于IBA濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L IBA培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基仍采用1/2MS B5+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，每個濃度下接種5瓶，每瓶2個不定芽。及時清理污染瓶，記錄每組未污染的生根數(shù)，比較IBA對不定芽生根的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對大豆種子消毒效果的影響 種子消毒是獲得大豆子葉節(jié)再生苗的第1步，也是關(guān)鍵一步。排除試驗操作染菌的情況，對大豆種子污染率進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)隨著升汞消毒時間的延長，污染率呈下降趨勢（見圖1），說明用0.1%HgCl2對寧鎮(zhèn)1號大豆種子進行消毒的最佳時間為12～16min。

2.2 不同濃度6-BA和TDZ對大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)的影響 表1為分別使用不同濃度6-BA和TDZ時寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)的誘導(dǎo)率情況。由表1可知：寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加呈先升后降的趨勢，當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L時誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，為10.0%;隨著TDZ濃度的增加，寧鎮(zhèn)1號大豆不定芽誘導(dǎo)率逐漸降低，當(dāng)TDZ濃度為0.1mg/L時誘導(dǎo)率最高，為22.5%。

2.3 不同濃度6-BA和TDZ組合對大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)的影響 表2為寧鎮(zhèn)1號大豆在不同6-BA和TDZ組合濃度下不定芽誘導(dǎo)率的變化情況。由表2可知：在不加入6-BA的情況下，不定芽誘導(dǎo)率隨TDZ濃度的升高而升高，當(dāng)TDZ濃度為0.10mg/L時誘導(dǎo)率為16.7%;將6-BA濃度保持為1.0mg/L不變，隨著TDZ濃度的升高，子葉節(jié)誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)6-BA濃度為1.0mg/L、TDZ濃度為0.05mg/L時寧鎮(zhèn)1號大豆的子葉節(jié)誘導(dǎo)率達(dá)到最高值33.0%;增大6-BA濃度至2.0mg/L，隨著TDZ濃度的增加，子葉節(jié)誘導(dǎo)率先升高后降低，TDZ濃度為0.05mg/L時誘導(dǎo)率較大，為15.0%;當(dāng)6-BA濃度增長至4.0mg/L時，在不同TDZ濃度下，寧鎮(zhèn)1號大豆不定芽誘導(dǎo)率普遍不高，可能是由于6-BA濃度過大，抑制了大豆子葉節(jié)分化成苗。由此可知，1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L TDZ組合最適合寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)不定芽的誘導(dǎo)。

2.4 不同IBA濃度對大豆子葉節(jié)再生植株生根的影響 當(dāng)再生植株生長至2～3cm時，將其轉(zhuǎn)移至1/2MS B5附加不同濃度的IBA的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。由表3可知，不同濃度IBA對寧鎮(zhèn)1號大豆子葉節(jié)誘導(dǎo)苗生根率的影響差異并不十分顯著，但對生長狀況有影響。隨著IBA濃度的增高，生根率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)IBA濃度為0.4mg/L時生根率最高（37.5%），且根的生長狀況較好;隨著IBA濃度繼續(xù)增大，其生根率又呈現(xiàn)下降趨勢，但根的生長狀況較好。因此，寧鎮(zhèn)1號子葉節(jié)最適合的生根培養(yǎng)基為1/2MS B5+IBA 0.4mg/L。

3 結(jié)論與討論

不同基因型大豆子葉節(jié)再生植株需要的條件不同，因此須通過試驗來探索其再生植株體系。根據(jù)大豆再生植株培養(yǎng)過程各階段的情況，更換不同配方的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽、生根。根據(jù)不同基因型大豆在培養(yǎng)過程中需要的各種條件，確定不同大豆所適合的再生植株體系。

賴冰冰等[1]以“遼豆17”、“遼豆18”和“遼豆23”等大豆品種的子葉節(jié)為外植體誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，得出當(dāng)向1/2MS B5培養(yǎng)基中添加0.05mg/L IBA和4.0mg/L 6-BA時不定芽的誘導(dǎo)率最高、1/2MS B5+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA是適宜的不定芽伸長培養(yǎng)基、1/2MS B5+1.0mg/L IBA是適宜的生根培養(yǎng)基等結(jié)論;曹榮等[3]以“小粒黃”大豆子葉節(jié)為外植體進行研究，結(jié)果表明：附加不同濃度6-BA和TDZ的1/2MS B5基本培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率在1.5mg/L 6-BA和0.2mg/L TDZ配比時達(dá)到最高（85.7%）;寇坤等[12]對大豆新品系黑農(nóng)56子葉節(jié)進行了組織培養(yǎng)研究，確定黑農(nóng)56最適的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA的B5培養(yǎng)基。

本試驗基于前人研究加以改進，選用寧鎮(zhèn)1號品種，以大豆子葉節(jié)為材料，探索其再生植株體系（圖2）。結(jié)果表明：寧鎮(zhèn)1號大豆種子用0.1%升汞消毒最合適的時間為12～16min，其子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽的最適宜激素配比為1.00mg/L 6-BA+0.05mg/L TDZ，生根最適合的IBA濃度為0.4mg/L。

試驗過程中，寧鎮(zhèn)1號大豆的子葉節(jié)誘導(dǎo)率及生根率都較低，且子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽最適的激素濃度也與前人研究結(jié)果不盡相同，誘導(dǎo)成功率總體不高。這可能是受大豆基因型影響，說明不同基因型大豆子葉節(jié)再生所需要的各種激素不同，這也是轉(zhuǎn)基因大豆較難獲得成功的原因之一。

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（責(zé)編：徐世紅）