基于巨噬細胞活性成像探針的研究進展

符純美　劉義成　張建標　張弛　晏麗　吳鵬　閆新豪

摘????? 要： 巨噬細胞是具有多功能的免疫細胞，在抵御病原體及組織損傷和重構方面發揮至關重要的作用。由于巨噬細胞影響機體內多個生物學進程，其活性檢測在炎癥微環境和腫瘤的基礎研究及診斷方面具有重要意義。成像探針以其選擇性強、靈敏度高、響應快、成本低廉等優點深受研究者的青睞，在醫學成像方面作為一種直觀、原位的可視化觀測技術，其在患者臨床結果的預測、治療方案的確定和治療反應的監測方面的應用已成為研究熱點。近年來，相繼發展了大量可用于生物體內巨噬細胞活性成像的探針，對各種成像探針及其應用情況進行綜述，并對未來研究方向進行展望。

關? 鍵? 詞：巨噬細胞;成像探針;腫瘤微環境;炎癥微環境;細胞成像

中圖分類號：TQ460.7+2? ??????文獻標識碼： A?????? ?文章編號： 1671-0460（2020）07-1509-05

Research Progress of Macrophage Activity Imaging Probe

FU Chun-mei， LIU Yi-cheng， ZHANG Jian-biao， ZHANG Chi， YAN Li， WU Peng， YAN Xin-hao*

（Hanzhong Vocational and Technical College， Hanzhong Shaanxi 723000， China）

Abstract： Macrophages are multifunctional immune cells， which play an important role in resisting pathogens and tissue damage and remodeling. Macrophages have close relationship with many biological processes in the body， their activity detection is of great significance in the basic research and diagnosis of inflammatory microenvironment and tumor. Imaging probe is favored by researchers for its advantages of high selectivity， high sensitivity， fast response and low cost. In medical imaging， as an intuitive， in-situ visual observation technology， it has become a research hotspot for the prediction of patients' clinical results， the determination of treatment plans and the monitoring of treatment response. In recent years， a large number of imaging probes which can be used to illustrate macrophage activity in vivo have been developed. In this paper， various imaging probes and their applications were reviewed， and the future research direction was prospected.

Key words： Macrophages; Imaging probe; Tumor microenvironment; Inflammatory microenvironment; Cell imaging

1 ?引言

高分辨光學成像技術為活體細胞的可視化成像及相關生物學事件動態監測提供了技術支持。近年來，隨著對熒光探針的不斷深入研究，通過特定信號分子或蛋白質激活發射熒光信號的化合物，以其高分辨、高信噪比和高靈敏度的特點正在敲開活細胞實時成像檢測的大門。這種熒光探針結構被認為是智能熒光團，通過合理的結構設計實現對目標物誘導的熒光響應，智能熒光團結構設計中用有機化學工具在分子片段中搭建“off-on”架構，用化學生物學方法提高探針靶向性。用于細胞活性成像的成像探針在生物學和醫學研究中提供了一系列的可能性，從活體內生物進程的監測到健康狀態和疾病狀態模式差異的可視化，從而應用于疾病診斷與新藥發現。

巨噬細胞在宿主防御中發揮重要功能，它們通過吞噬作用清除凋亡細胞、碎片及病原體;通過分泌細胞因子、酶及其他因子形成炎癥反應;通過向淋巴細胞呈遞抗原來調節適應性免疫（獲得的特異性免疫能力）。雖然這些功能將有益于宿主，但越來越多的證據表明巨噬細胞在一些情況下也可能有害，例如：惡性腫瘤組織有大量的巨噬細胞，稱作腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophages， TAMs），作為一種炎癥反應的組成部分，參與腫瘤細胞外基質構建^[1]。腫瘤可通過遠距離分泌方式分泌多種生物活性因子，使巨噬細胞祖細胞從腫瘤基質中擴增出來，在局部腫瘤微環境中聚集從而發揮其作用，這些TAMs促進腫瘤增生及轉移功能的獲得，并在腫瘤浸潤、轉移過程中扮演著十分重要的角色，研究表明具有豐富的TAMs的腫瘤進展速度更快^[2-5]。巨噬細胞參與炎癥的發生及動脈粥樣硬化斑塊的形成^[6]，容易導致心腦血管系統疾病（如心肌梗死與中風）的發病，心肌梗死后不受控制的炎性巨噬細胞可引起心室重塑、心力衰竭和死亡，以及類風濕關節炎^[7]、肥胖^[8]和糖尿病^[9]等疾病的發生，因此對組織巨噬細胞（密度、流量、功能和亞型）的成像監測具有重要的臨床和研究應用價值。

成像探針以其選擇性強、靈敏度高、響應快、成本低廉等優點深受研究者的青睞，在醫學成像方面作為一種直觀、原位的可視化觀測技術用于患者臨床結果的預測、治療方案的確定和治療反應的監測。巨噬細胞通過分泌細胞因子、酶和活性氧（ROS）在宿主對感染性疾病的反應中發揮作用，這些特性可以作為成像診斷和新藥研發的靶點，促進了巨噬細胞活性監測成像探針的發展。近年來，相繼發展了大量可用于生物體內巨噬細胞活性成像探針，本文對各種成像探針及其應用情況進行綜述，并對未來研究方向進行展望。

2 ?設計策略

ROS和活性氮（RNS）與巨噬細胞的許多功能直接相關?；罨木奘杉毎僧a生大量的ROS，生理或病理條件下，巨噬細胞產生釋放的ROS對微生物的吞噬作用、炎癥反應和組織損傷產生重要影響。巨噬細胞釋放ROS作為第二信使來調節參與細胞增殖、凋亡和基因表達的信號通路。過氧化氫（H₂O₂）是巨噬細胞內最重要的內源性ROS之一。在吞噬細胞時，氧化酶Nox2被激活產生超氧化物（O₂˙?），其發生歧化形成H₂O₂和隨后的次氯酸（HOCl）。由于其存在時間短，巨噬細胞中H₂O₂含量在納摩爾范圍內，因此需要高度靈敏的探針進行實時成像。大多數用于巨噬細胞中H₂O₂可視化的成像探針依賴于含有H₂O₂響應的熒光團。硼酸酯^[10]、膦酸酯^[11-12]和苯甲酰羰基^[13]被用來作為ROS信號導入基團，這些基團引入到熒光團特定位置用于調節內部電荷或電子轉移性質，使得熒光只在H₂O₂化學選擇性切割時引起。

3? 研究進展

2010年Chang課題組^[10]設計合成了一系列不同發光色的成像探針1（如圖 1），硼酸酯連接于熒光素或羅丹明發光團的酚羥基處實現熒光信號的開關，具有激發發射光譜可調諧的優點和對內源性H₂O₂細胞水平的敏感響應的特性。該探針應用于巨噬細胞吞噬性呼吸爆發成像檢測，在多色成像實驗中，具有擇性地鑒別活的巨噬細胞中H₂O₂和次氯酸（HOCl）水平的變化。此外，當用合成的成像探針和標記的巨噬細胞被刺激以誘導免疫應答時，發現了3種不同類型的吞噬體，用于區別不同的ROS，探針表現出對過氧化氫良好的選擇性，對兩種豚尸體實現了檢測，有助于揭示ROS在細胞中的生成及分布。

2018年，Shao等^[14]設計合成了探針2 （如圖 2），該報道提出了一種新型的多通道信號電化學熒光探針，用于活體細胞中H₂O₂的成像和檢測。探針由H₂O₂反應位點硼酸酯和4-二茂鐵基（乙烯基）吡啶單元組成，提供顯色、熒光和電化學信號。這些結構單元在單分子中集合了顯色、熒光和氧化還原傳感功能。裸眼觀察，當H₂O₂加入含探針的緩沖溶液中時，觀察到從淡紅色到無色的明顯顏色變化;在激發光激發下，探針顯示出對H₂O₂的高靈敏度和選擇性的“turn on”熒光響應，這可以應用于監測細胞內H₂O₂活性;電化學檢測時，加入H₂O₂后，探針的電化學響應信號降低，可作為檢測活細胞釋放H₂O₂的簡便方法，該探針成功應用于巨噬細胞釋放H₂O₂的成像檢測。

2007年，Tang等^[15]設計合成了基于膦酸酯響應的探針3（如圖 3），以熒光素作為發光團，膦酸酯基作為與O₂˙?反應位點，脫保護后表現為“turn on”模式得到熒光素，探針合成方法簡單、新穎。在與O₂˙?反應時，該探針具有較強的熒光響應性、對細胞內其他ROS高選擇性且檢測線性范圍寬、檢測極限低的優點，添加超氧化物歧化酶清除劑證實了探針對O₂˙?特異性反應。探針具有良好的選擇性、高靈敏度、良好的水溶性和響應性應用于小鼠腹膜巨噬細胞成像，攜帶探針的巨噬細胞顯示細胞內弱背景熒光，當PMA激發后表現了強熒光信號，這些結果表明探針能特異性地響應活細胞內O₂˙?濃度的變化，該探針將有助于研究超氧化物介導的細胞代謝與損傷修復中的作用及其機制。

2017年，Liu等^[16]報道了基于喹啉衍生物雙光子熒光探針4（如圖 4），6-二甲氨基-喹啉-2-苯并噻唑啉。該探針噻唑啉環與O₂˙?反應得到噻唑環延長π-共軛激活熒光信號，探針在O₂˙?濃度范圍內具有選擇性和快速的“開啟”響應，在濃度范圍內具有良好的線性相關性和穩定性。此外，探針在細胞內和生物體顯示出良好的雙光子熒光特性、優異的光學穩定性、低的細胞毒性、優異的組織穿透性。首次通過雙光子熒光成像技術跟蹤體內炎癥組織內源性產生的O₂˙?指示劑，這顯示了快速原位檢測活生物體中炎癥反應的潛力，有望成為研究超氧陰離子在各種生理和病理過程作用機制的有力工具。

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基金項目：陜西省教育廳科研計劃項目（項目編號：18JK0922和18JK0921）;漢中職業技術學院科研計劃項目（項目編號：HZYKYZD201701）;

中科院“西部青年學者”B類項目（項目編號：Y82A570Q10）。

收稿日期：2020-02-11

作者簡介：符純美（1978-），女，陜西漢中人，講師，碩士，2010年畢業于沈陽藥科大學生物藥學專業，研究方向：藥物檢測分析和新藥研發。E-mail：920175446@qq.com。

通訊作者：閆新豪（1982-），男，教授，博士，研究方向：納米醫學。E-mail：wide123@163.com。