米糠渥堆發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物和菌群變化研究

摘????? 要：米糠是很好的發(fā)酵飼料原料，但其固態(tài)發(fā)酵過程中的菌群及其代謝產(chǎn)物變化卻少有報(bào)道。本文以全脂米糠為單一發(fā)酵原料，分別接種發(fā)酵乳桿菌MRS8、枯草芽孢桿菌ZLK1或地衣芽孢桿菌BL50，研究發(fā)酵過程中乳酸、乙酸、乙醇等代謝產(chǎn)物及其菌群的變化情況。發(fā)酵起始時(shí)，米糠中乳桿菌科占比在80%以上，隨著發(fā)酵啟動，空白組中腸桿菌科增殖很快，但乳酸含量變化最小。發(fā)酵乳桿菌MRS8組乳酸升高最快，兩天達(dá)到最大值。枯草芽孢桿菌ZLK1組乳酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長持續(xù)升高。研究表明：外加益生菌株發(fā)酵可以提高米糠發(fā)酵的乳酸含量，并降低有害菌的豐度。

關(guān)? 鍵? 詞：發(fā)酵乳桿菌;枯草芽孢桿菌;地衣芽孢桿菌;乳酸

中圖分類號：TQ 929????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1406-04

Study on Metabolites and Microbial Changes in

Rice Bran During Fermentation

LU Zong-mei

（COFCO Biotechnology Co.， Ltd.， Bengbu Anhui 233010， China）

Abstract： Rice bran is a good raw material for fermented feed， but the changes in the flora and its metabolites during the fermentation process are not well studied. In this paper， the rice bran was inoculated with Lactobacillus fermentum MRS8， Bacillus subtilis ZLK1 or Bacillus licheniformis BL50， respectively. The changes of lactic acid， acetic acid， ethanol and other metabolites and their flora during fermentation were studied. At the beginning of fermentation， the proportion of Lactobacillaceae in rice bran was above 80%. Compared to other three treatment groups， the abundance of Enterobacteriaceae in the blank group proliferated quickly， but the change of lactic acid content was the least. The lactic acid in rice bran treated by the Lactobacillus fermentum MRS8 increased very quickly and reached the maximum in two days. The lactic acid in rice bran treated with Bacillus subtilis ZLK1 continued to increase with the fermentation. The study shows that probiotic strain fermentation can increase the lactic acid of rice bran and reduce the abundance of harmful bacteria Enterobacter.

Key words： Lactobacillus fermentum; Bacillus subtilis; Bacillus licheniformis; Lactic acid

發(fā)酵飼料富含益生菌及活性代謝產(chǎn)物，在畜禽養(yǎng)殖中有望替代飼用抗生素而日益受重視^[1-2]。米糠是稻谷加工成精米剩余的種皮和胚，是稻谷加工的主要副產(chǎn)物，占稻谷總重5%～8%。2016年我國稻谷產(chǎn)量為20 693.4萬t，由此推算每年可產(chǎn)米糠約1 000萬t以上。米糠中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及活性功能成分，是非常好的食品、飼料原料 ^[3-4]。目前，米糠已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品以及發(fā)酵飼料的生產(chǎn)，但米糠發(fā)酵過程中的物理化學(xué)變化和菌群的變化研究還比較少。本文就單一米糠發(fā)酵過程中的代謝物和菌群變化進(jìn)行了研究，為米糠的發(fā)酵利用提供參考。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 試驗(yàn)材料

全脂米糠由中糧飼料科技公司提供。發(fā)酵菌株發(fā)酵乳桿菌MRS8和地衣芽孢桿菌BL50由中糧營養(yǎng)健康研究院分離并提供，枯草芽孢桿菌ZLK1由中糧生物科技股份公司分離保存。MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2? 儀器設(shè)備

DL-CJ-2ND I型超凈臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;IMH100-SSS型培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司;高效液相色譜儀，安捷倫1260，色譜柱：Bio-RadAminex HPX-87HColumn（300 mm×7.8 mm 8 μm）;紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3? 試驗(yàn)方法

發(fā)酵種子液制備：將發(fā)酵乳桿菌MRS8接種到含有100 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，將枯草芽孢桿菌ZLK1和地衣芽孢桿菌BL50分別接種到含有100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，

150 r·min^-1，37 ℃培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵種子液，5 000 r·min^-1離心10 min，棄去上清，留下菌泥，加入相應(yīng)量的無菌水，將3個菌的濃度分別調(diào)至OD600 nm為5.63。

渥堆發(fā)酵：米糠發(fā)酵處理如表1所示。將混合均勻的米糠分別放入10 L敞口塑料桶內(nèi)，放置在25～30 ℃房間內(nèi)自然發(fā)酵，并監(jiān)測溫度，每天早、晚翻攪一次。每個發(fā)酵處理每隔24 h 收集樣品100 g，連續(xù)收集7天。收集的樣品馬上放置于-80 ℃凍存，用于有機(jī)酸及菌群多樣性的檢測。

1.4? 指標(biāo)測定

1.4.1 ?發(fā)酵過程中乳酸等代謝產(chǎn)物測定

米糠中的代謝產(chǎn)物測定參照賈錚等^[5]液相方法略做修改，以5 mmol·L^-1硫酸溶液為流動相，流速0.50 mL·min^-1，柱溫55 ℃，DAD檢測波長為210 nm，以保留時(shí)間結(jié)合待測物質(zhì)的紫外特征吸收光譜進(jìn)行定性分析，結(jié)合外標(biāo)法進(jìn)行定量。液相樣品制作如下：準(zhǔn)確稱取2.00 g發(fā)酵米糠，加入48 mL蒸餾水中，震蕩混勻30 min，用手持pH計(jì)測定pH并記錄數(shù)值，然后用漏斗過濾得到粗濾液，粗濾液再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾放入液相瓶中，標(biāo)記好樣品名稱，上機(jī)檢測。

1.4.2 ?發(fā)酵過程中菌群變化分析

將-80 ℃凍存的樣品用干冰郵寄至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA 的V3-V4區(qū)域擴(kuò)增、測序及數(shù)據(jù)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及代謝產(chǎn)物變化

2.1.1 ?米糠渥堆發(fā)酵過程中pH值變化

隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，除ZLK1處理組一直降低外，其他3組先降低后升高。地衣芽孢桿菌BL50處理組和CK空白組pH的走勢比較一致，且pH在第3天降低到最低點(diǎn)后回升。而發(fā)酵乳桿菌MRS8組在前24 h pH降低最陡而后變緩，到48 h達(dá)到最低之后開始回升（見圖1），表明在前24 h，乳酸菌生長代謝很活躍，產(chǎn)生乳酸較多，pH下降較快。

2.1.2 ?發(fā)酵過程中乳酸等代謝產(chǎn)物變化

從液相檢測的結(jié)果來看，發(fā)酵第2天，發(fā)酵乳桿菌MRS8組乳酸產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到最高值29.18 g·kg^-1，兩個芽孢桿菌組還在5 g·kg^-1，而空白組中乳酸含量基本沒有變化（見圖2、 表2）。空白組的乳酸在整個發(fā)酵過程中升高最小，而ZLK1組隨著時(shí)間延長乳酸含量進(jìn)一步增加，并高于發(fā)酵乳桿菌MRS8組，這也是pH隨時(shí)間延長逐漸降低的原因。整個發(fā)酵過程中乙酸、乙醇的變化不明顯（見表2）。液相數(shù)據(jù)中乳酸的積累與pH值的變化相一致。

2.2? 發(fā)酵過程中菌群變化

從測序結(jié)果來看，米糠中乳桿菌科的豐度最高（占比75%～95%），其次是腸桿菌科，兩者之和占比將近95%（見圖3）。在發(fā)酵過程中，各組的菌群變化差異很大，外接菌種作用效果明顯。從起始（d0）、2天（d2）、5天（d5 ）到7天（d7），空白組CK 中乳桿菌科依次變化為 82.25%、8.43%、26.61%和59.42%，而腸桿菌科依次為8.87%、87.5%、64.65%和34.02%。前48 h，乳桿菌科細(xì)菌豐度下降很快而腸菌科上升很快，后3天，乳桿菌科細(xì)菌又逐漸增加并成為最優(yōu)勢菌，而腸菌科則大大降低。發(fā)酵乳桿菌MRS8組，乳桿菌科細(xì)菌的變化依次為96.87%、86.71%、60.24%、86.96%，腸桿菌科依次為0.39%、5.68%、22.57%和3.90%，整個發(fā)酵過程中乳桿菌科都是最優(yōu)勢菌群，并且腸菌科細(xì)菌的生長被很好地被抑制了。

再看地衣芽孢桿菌BL50組，乳桿菌科細(xì)菌的變化依次為90.57%、67.60%、79.74%和88.29%，腸桿菌科細(xì)菌的變化依次為4.00%、16.33%、16.72%和8.82%，而芽孢桿菌科依次為0.42%、10.32%、2.15%和1.22%，這與發(fā)酵乳桿菌組有點(diǎn)相似，地衣芽孢桿菌在前24 h有較快的生長，且地衣芽孢桿菌BL50和乳桿菌科細(xì)菌有很好的協(xié)同，這使乳桿菌科在整個發(fā)酵過程中始終維持第一優(yōu)勢地位。而枯草芽孢桿菌ZLK1組，乳桿菌科細(xì)菌的變化依次為73.83%、15.78%、49.69%和62.80%，腸桿菌科變化依次為22.05%、24.94%、8.34%和5.34%，芽孢桿菌科變化依次為0.90%、56.79%、9.36%和29.35%，表明發(fā)酵前24 h，枯草芽孢桿菌增殖很快，并抑制了乳桿菌科細(xì)菌的生長，而在發(fā)酵的后5天，對乳桿菌科細(xì)菌的生長沒有抑制。

從科的水平比較細(xì)菌變化比較籠統(tǒng)，因此從OTU水平來比較。從表中可以看到，米糠發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢菌有8種，在發(fā)酵起始時(shí)，乳桿菌科的OTU1占比最高（61%～96%），隨著發(fā)酵開始，米糠中乳酸片球菌屬（OTU2、OTU3）快速增殖（除MRS8外）， 尤其是BL50組，增長非常快，表明BL50有促進(jìn)乳酸片球菌生長的作用。

空白組（CK） 腸桿菌科（OTU6、 OTU7、 OTU8）在發(fā)酵前24 h較快增殖并維持一定比重。而在其他3個接種益生菌株的發(fā)酵米糠中，尤其是發(fā)酵乳桿菌MRS8組，腸桿菌科細(xì)菌生長受到了極大限制，豐度一直極低，兩芽孢桿菌組中腸桿菌科細(xì)菌豐度稍高，但也隨著發(fā)酵時(shí)間延長而降低（表3）。

3? 結(jié) 論

從米糠發(fā)酵結(jié)果來看，菌群變化與乳酸含量及pH值變化息息相關(guān)，且乳酸片球菌屬在米糠發(fā)酵過程中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。發(fā)酵乳桿菌MRS8在前48 h生長較快并產(chǎn)生大量乳酸，抑制腸菌科細(xì)菌生長。枯草芽孢桿菌ZLK1可以促進(jìn)乳酸菌的生長，并能抑制利用乳酸作為碳源的細(xì)菌生長，從而使乳酸在發(fā)酵過程中持續(xù)積累。不同的菌株發(fā)酵的效果很不一樣，不添加外源菌，米糠也能很好地發(fā)酵，但腸桿菌科豐度高，而腸桿菌科多數(shù)是有害菌，并且發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量低。因此，米糠自菌發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵飼料質(zhì)量會比較差。

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收稿日期：2020-03-09

作者簡介：盧宗梅（1970- ），女，安徽蚌埠人，高級工程師，研究方向：微生物發(fā)酵工程。E-mail：liulu1996@163.com。