負載光敏劑的生物可降解納米藥物載體用于腫瘤的光動力治療

何艷梅　施文強　蔡勝勝　梅蘅　曹俊

摘????? 要：探討了生物可降解納米藥物載體負載光敏劑的光動抗癌療效。以左旋乳酸為單體，1，6-己二醇為引發劑，采用開環聚合方法合成左旋聚乳酸，再將帶正電荷的三苯基膦通過酯化反應鍵合到聚乳酸末端，核磁氫譜結果表明成功地合成了三苯基膦改性的聚乳酸。該聚合物在水中可自組裝形成表面帶正電荷的納米粒子（TppT），光敏劑二氫卟吩e6（Ce6）可通過π-π共軛、疏水等作用負載于TppT中形成表面為負電的納米粒子（TppT@Ce6）。動態光散射和透射電鏡結果表明，TppT@Ce6具有球形結構，且負載Ce6后粒徑增加、電位降低。TppT@Ce6在10%的血清中的粒徑和分布變化較小，具有良好的穩定性。細胞實驗結果表明，TppT@Ce6在無激光照射時細胞生長率大于80%;激光照射后，表現出較強的細胞毒性。以上結果表明，本研究所構建的生物可降解納米藥物載體可實現高效的抗腫瘤效果。

關? 鍵? 詞：π-π共軛;聚乳酸;光敏劑;光動力治療;納米藥物載體

中圖分類號：TQ 317?????? 文獻標識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1351-05

Application of Biodegradable Nano-drug Carriers Loaded With

Photosensitizers in the Photodynamic Therapy of Tumors

HE Yan-mei， SHI Wen-piang， CAI Sheng-sheng， MEI Heng， CAO Jun

（Biomaterials Engineering Research Center， Sichuan University， Chengdu Sichuan 610065， China）

Abstract： The photodynamic anti-cancer efficacy of biodegradable nanoparticles drug carrier loaded with photosensitizer was explored. With sinistral lactic acid as monomer， 1，6-diol as initiator， levorotatory polylactic acid was compounded by ring opening polymerization method， then positively charged triphenylphosphine was bonded at the terminal of polylactic acid through esterification reaction.Hydrogen nuclear magnetic spectra results showed that the triphenylphosphine modified polylactic acid was successfully synthesized. The polymer could be self-assembled in water to form positively charged nanoparticles（TppT）， and the photosensitizer chlorin e6（Ce6） could be loaded into the TppT by π-π conjugation and hydrophobicity to form negatively charged nanoparticles（TppT@ce6）.The results of dynamic light scattering and transmission electron microscopy showed that TppT@ce6 had spherical structure， the particle size increased and the potential decreased after the load of Ce6. The particle size and distribution of TppT@ce6 in 10% serum had little change and good stability. The survival rate of TppT@ce6 without laser irradiation was more than 80%. After laser irradiation， cells showed strong cytotoxicity. The above results indicated that the biodegradable nano-drug carrier constructed in this study achieved effective anti-tumor effect.

Key words： π-π conjugation; Polylaticacid; Photosensitizer; Photodynamic therapy; Nano-drug carriers

癌癥是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一，《2018 年全球癌癥報告》預計全球癌癥新發病例近2 000 萬，而死亡病例高達1 200 萬，中國癌癥發病率和死亡率高居榜首^[1]。手術切除、化療、放療和光動力治療等是腫瘤治療最常用的手段。光動力治療（PDT）因其療效確切、創傷小、毒性小等優勢已廣泛應用于腫瘤治療^[2-4]。然而，常用的光敏劑，如卟啉（PpIX），二氫卟吩（Ce6）等，因其水溶性差、半衰期短、靶向性低等缺點導致治療效果不理想^[5-8]。納米藥物載體因其獨特的納米級尺寸，可通過實體瘤的高通透性和滯留效應（EPR）將光敏劑靶向遞送到腫瘤部位富集，提高其在腫瘤部位的質量濃度，進而增強光動力治療效果^[9-11]。此外，納米藥物載體可通過疏水或π-π共軛等作用將疏水光敏劑包裹于載體內，進而提高其水溶性^[12-14]。生物可降解聚合物，如聚乳酸、聚己內酯等因其良好的生物相容性和生物降解性被廣泛用于構建納米藥物載體^[15-17]。三苯基膦（TPP）作為常用的線粒體靶向分子，通常被引入到納米藥物載體中用于藥物的靶向遞送。此外，研究報道，由于TPP具有相對親水的特性，將其引入到生物可降解高分子中，如聚己內酯（PCL），可形成相對兩親性聚合物^[18]，在水中自組裝形成納米粒子。除靶向功能外，TPP分子富含的π-π共軛基團，使其可望通過多重作用力，如π-π共軛、疏水等，負載疏水性光敏劑分子從而構建納米藥物載體。

本研究通過將帶正電荷的三苯基膦鍵合到生物可降解的聚乳酸末端，形成具有相對親疏水性能的聚合物（Tpp-PLLA-HI-PLLA-Tpp）。該生物可降解聚合物可在水中自組裝形成表面帶正電荷的納米粒子，同時可通過π-π共軛、疏水等作用力將二氫卟吩負載到納米粒子中，形成負載Ce6的生物可降解納米粒子（TppT@Ce6）。系統研究了TppT@Ce6在水中的自組裝行為、熒光性能、穩定性及光動力治療效果。

1 ?實驗

1.1? 材料

左旋乳酸（LLA，希恩思），4-羧丁基三苯基鏻（Mw= 443 Da， Sigma-Aldrich），二氫卟吩e6（Ce6，希恩思），三氟乙酸酐（99%， Adamas），辛酸亞錫（99.5%， Sigma-Aldrich）， 1，6己二醇（HI，Aladdin），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC，希恩思）， 4- 二甲氨基吡啶（DMAP， Sigma- Aldrich），N-羥基磺基琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS，希恩思）;甲苯，二甲亞砜，乙醚和二氯甲烷均購于成都科龍試劑公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma- Aldrich）;1640培養基，青霉素-鏈霉素（雙抗100X）和胰酶都購買于美國洛根公司;胎牛血清購買于gibco公司;小鼠乳腺癌細胞（4T1）購買于中國科學院細胞庫。

1.2 ?三苯基膦改性的聚乳酸的合成及表征

準確稱取左旋乳酸（LLA，3.23 mg，21.9 mmol）和1，6 己二醇（1.77 g，10 mol）加入聚合管中，真空干燥4 h，快速加入0.1%底物質量的辛酸亞錫甲苯溶液。待真空除掉甲苯后，將封管后的反應瓶置于125 ℃油浴中攪拌反應 48 h。反應結束后，聚合管冷卻到室溫，加入10 mL二氯甲烷溶解，冰乙醚沉淀得到白色固體物質，真空干燥24 h至恒重，得到左旋聚乳酸（PLLA）。

將4-羧丁基三苯基鏻（147.7 mg，0.33 mmol），EDC（63.9 mg，0.33 mmol），DMAP （40.7 mg

0.33 mmol）和 TEA（0.2 mL，0.002 mmol）溶于二氯甲烷中，真空充/放氮氣3次，室溫條件下攪拌反應3 h，得到羧基活化后的三苯基膦。將PLLA

（2 000 mg，2 mmol）溶于5 mL的二氯甲烷，并緩慢加入羧基活化后的三苯基膦反應液中，攪拌反應48 h。反應結束后經過透處理得到Tpp-PLLA- HI-PLLA- Tpp。通過核磁共振氫譜（Bruker，AV-40）表征聚合物的結構，以CDCl₃為溶劑、四甲基硅烷（TMS）為內標，測試頻率為 400 MHz。

1.3? 空白納米粒子及負載光敏劑納米粒子的制備

將750 μg的Tpp-PLLA-HI- PLLA- Tpp溶于200 μL的四氫呋喃中，超聲40 min混和均勻，將其緩慢滴加到2 mL去離子水中，待溶劑揮發完后，靜置取上清夜得到空白納米粒子（TppT）。

將Tpp-PLLA-HI- PLLA- Tpp（750 μg）和Ce6 （75 μg）溶解于200 μL的四氫呋喃中，超聲40 min混和均勻。將其緩慢滴加到2 mL去離子水中，攪拌至其溶劑完全揮發完后，靜置取上清夜得到負載光敏劑的納米粒子（TppT@Ce6）。

1.4? TppT@Ce6形貌測試

將TppT@Ce6均勻滴加在場發射透射電子顯微鏡（FEI，Tecnai G2 F20 S-TWIN）專用銅片上，等待水溶劑完全揮發后，用2%的磷鎢酸溶液進行染色3 min，再用濾紙除去多余磷鎢酸，再靜置一段時間后用于觀察形貌。

1.5? 粒徑、電位及TppT@Ce6的熒光測試

TppT及TppT@Ce6的粒徑及電位通過 Nano ZS型動態光散射儀（英國馬爾文儀器公司）進行測試，測試溫度為 25 ℃，分散介質為水，折射系數 1.33，波長為 633 nm，散射角度為90°。

將Ce6 （5 mg）溶解于5 mL的V （DMSO）∶V（H₂O）=9∶1的混合溶液。稀釋該溶液至質量濃度為 0.6、0.5、0.25、0.125、0.01 μg·mL^-1。通過熒光分光光度計（型號：F-7000， Japanese Hitachi）測試其不同Ce6質量濃度下的熒光發射光譜，其中激發波長為400 nm。同樣，將TppT@Ce6 溶解于DMSO 中，測試在波長400 nm的激發下的熒光發射光譜。

1.6? TppT@Ce6的穩定性測試

將TppT@Ce6和TppT于室溫放置0、4、8、12 h后，采用Nano ZS型動態光散射儀測試其粒徑及分散系數。將TppT@Ce6和TppT分別與10%的胎牛血清共培養0 、4、8 h后測試其粒徑。

1.7? TppT@Ce6的光動療效

選取小鼠乳腺癌細胞（4T1）為細胞株，加入10 %胎牛血清以及 1 %雙抗（100 U·mL^-1 青霉素和 100 U·mL^-1鏈霉素）的 RPMI 1640 培養基于37 ℃恒溫培養箱進行培養。隨后利用胰酶消化制得 4T1 單細胞懸液體，用 1640 培養基稀釋后，吹打均勻，取 100 μL含4T1細胞的培養基置于 96 孔板中， 37 ℃體積分數為5% CO₂的培養箱培養24 h后，去除培養基，分別加入100 μL不同質量濃度的含培養基的TppT@Ce6和TppT（以TppT為標準，Ce6質量濃度依照TppT換算），每個質量濃度均設置3個平行樣。空白對照組為單純的培養基培養。待培養12 h后，激光照射3 min再繼續培養12 h。隨后去掉納米粒子，加入100 μL PBS洗滌兩次，再加入含有10 μL的5 mg·mL^-1噻唑藍（MTT）的無血清培養基，放入培養箱中孵育4 h。培養結束后，吸除MTT溶液，加入100 μL DMSO，37 ℃恒溫搖床震蕩20 min。采用酶標儀（型號）測定在波長490 nm處的吸光值，通過下面的公式計算出細胞存活率。無激光照射組，除無激光照射3 min外，其他操作步驟相同。

式中：R— 細胞存活率，%;

A_x— 實驗組的吸光度值;

A_b— 對照組的吸光度值;

A_c— 空白組的吸光度值。

2? 結果與討論

2.1? Tpp-PLLA-HI-PLLA-Tpp結構表征

Tpp-PLLA-HI-PLLA-Tpp的合成路線和核磁氫譜圖如圖1所示。當通過酯化反應將Tpp鍵合到PLLA 末端時，三苯基膦與羰基相鄰的質子特征峰出現在δ=（1.83～1.89）×10^-6，δ=（1.96～2.07）×10^-6，δ=（2.29～2.39）×10^-6;PLLA主鏈上次甲基特征峰出現在δ=（5.07～5.29）×10^-6和δ=（5.07～5.29）×10^-6。δ=（1.25～1.65）×10^-6為PLLA鏈段甲基的質子峰。δ=（7.50～7.80）×10^-6為三苯基膦上苯環對應的質子振動峰。δ=（1.25～1.41）×10^-6，δ=（1.49～1.51）×10^-6和δ=（4.1～4.2）×10^-6是1，6-己二醇上的質子峰。以上核磁結果表明，成功地合成了目標聚合物（Tpp-PLLA-HI-PLLA- Tpp）。

2.2? TppT@Ce6的粒徑、電位及形貌表征

如圖2（A）所示，帶正電的三苯基膦改性聚乳酸（Tpp-PLLA-HI-PLLA-Tpp）與光敏劑分子Ce6可在水中通過疏水、π-π共軛等作用力自組裝形成負載光敏劑的納米粒子（TppT@Ce6）。圖2（B）結果顯示Tpp-PLLA-HI-PLLA-Tpp可利用親疏水性自組裝成粒徑為137 nm、電位為26 mV納米粒子，說明Tpp作為相對親水的鏈段覆蓋于PLLA為內核的納米粒子表面。當負載了Ce6后，其粒徑增加到193 nm、電位降低到-8 mV。粒徑的增加主要歸因于疏水光敏劑Ce6的引入導致聚合物親水性比例發生變化，當再次自組裝時，疏水內核增大，需以較大的粒徑狀態才可到達穩定。此外，電位的降低證明Ce6可負載到納米粒子中。透射電鏡的結果如圖2（D）所示，納米粒子呈圓球形，尺寸大小分布均勻，粒徑約為200 nm左右，與用DLS所檢測到的粒徑相吻合。以上結果說明疏水光敏劑Ce6成功地負載到TppT納米粒子中。

2.3? TppT@Ce6熒光光譜

如圖3所示，在400 nm的激發下，游離的Ce6在670 nm附近出現了最大發射峰，且隨著質量濃度的增加而增加。將Ce6負載于TppT中，熒光光譜結果顯示在670 nm附近出現相同的發射峰，說明Ce6成功包裹于TppT中且具有與游離Ce6同樣的熒光效應。以上結果表明負載到納米粒子中的Ce6到達腫瘤部位后，未改變的熒光特性，可展現光動力治療效果。

2.4? TppT@Ce6的穩定性

納米藥物載體系統因其結構不穩定易在血液循環中泄露藥物，進而導致到達腫瘤部位的藥物質量濃度降低，影響其抗腫瘤效果，同時對正常組織產生一定的毒性。因此，本研究考察了存放時間及血清對TppT@Ce6穩定性的影響。如圖4（A）、 圖4（B）所示，TppT@Ce6儲存不同的時間粒徑和分散系數均變化較小，在0、4、8、12 h時的粒徑均為190 nm左右，分散系數0.1左右。

與血清培養后，如圖4（C）、圖4（D）所示，TppT的粒徑在與血清培養4 h后達到1 600 nm，主要是由于帶正電荷的TppT易與血清中的蛋白相互作用發生聚集，進而影響納米粒子的穩定性^[19]。

當負載Ce6后，TppT@Ce6的粒徑略有增加，說明表面帶負電荷的納米粒子可阻止血清中的蛋白吸附，進而保持納米結構的完整性^[20]。以上結果表明，將Ce6負載到納米粒子中具有更好的穩定性。

2.5? TppT@Ce6的光動治療效果

通過MTT法考察TppT和 TppT@Ce6的細胞相容性及光動力治療效果。將不同質量濃度的TppT和TppT@Ce6與4T1共培養24 h，結果如圖5（A）（C）所示。無激光照射時，TppT和 TppT@Ce6在質量濃度低于4.36 μg·mL^-1時，細胞存活率都高達80%。當質量濃度增加到8.72 μg·mL^-1時，TppT@Ce6的細胞存活率比TppT要高，說明表面帶帶正電荷的TppT具有一定的細胞毒性，而通過包裹Ce6后形成的表面負電荷納米粒子，表現出更好的細胞相容性。

當施加激光照射時，TppT在低質量濃度的細胞存活率和未光照時基本一致，均高于80%，說明激光照射對細胞的活性無影響。對于TppT@Ce6組，激光照射后，表現出明顯的細胞毒性，當質量濃度為0.32 μg·mL^-1，細胞的存活率低于50%，說明具有納米結構的TppT@Ce6可以進入細胞，并在光照的條件下Ce6產生活性氧，抑制細胞的生長，進而表現出良好的抗腫瘤效果。

3? 結 論

本文通過開環聚合和酯化反應成功地合成了三苯基膦改性的聚乳酸。合成的生物可降解聚合物可自組裝形成帶正電荷的納米粒子，對疏水光敏劑Ce6具有良好的負載能力且不影響Ce6的光學性能。 負載Ce6后的納米粒子表現出良好的穩定性及高效的光動力治療效果。因此，本研究所構建的納米藥物載體系統可實現對疏水藥物的高效負載且表現出較好的抗腫瘤效果。

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收稿日期： 2020-04-02

作者簡介：何艷梅（1994-），女，新疆自治區庫爾勒市人，碩士研究生，研究方向：多功能納米給藥系統。E-mail：heyanmeiedu@163.com。

通訊作者：曹俊（1986-），女，副教授，碩士生導師，研究方向：多功能藥物載體。E-mail：caojun@scu.edu.cn。