參苓白術散中甘草黃酮和人參皂苷測定及抗氧化實驗

王悅　王婭玲　鄒婧　張昊葳　梁峰源　高世杰

摘????? 要：采用高效液相法測定參苓白術散中人參皂苷和甘草黃酮的含量，為下一步探究參苓白術散的體外抗氧化活性研究做準備。方法：采用HPLC法（反相高效液相法），目的：為測定參苓白術散中的甘草黃酮、人參皂苷含量，進行線性范圍的考察和實驗方法學研究，同時測定參苓白術散中人參皂苷對羥自由基的抑制情況。結果：人參皂苷Rg₁、槲皮素、人參皂苷Re、蘆丁分別在0.625～5.000 μg、0.250～1.000 μg、0.375～3.000 μg、0.250～1.000 μg 內對羥自由基的抑制作用顯著;蘆丁的平均質量分數為0.295 5 mg·g^-1;人參皂苷Rg₁的平均質量分數為0.193 mg·g^-1;槲皮素的平均質量分數為0.243 9 mg·g^-1;人參皂苷Re的平均質量分數為0.074 7 mg·g^-1。參苓白術散的抗氧化能力經驗證也較為明顯，人參皂苷對羥自由基的抑制率為79%。

關? 鍵? 詞：高效液相法;參苓白術散;甘草黃酮;人參皂苷

中圖分類號：TQ496 ???????文獻標識碼：A?? ????文章編號：1671-0460（2020）07-1301-04

Determination of Licorice Flavonoids and Ginseng Saponins

in Shenling Baizhu Powder and Antioxidant Tests

WANG Yue， WANG Ya-ling， ZOU Jing，ZHANG Haowei，LIANG Feng-yuan， GAO Shi-jie

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： The content of ginsenosides and licorice flavonoids in Shenling Baizhu Powder was determined by HPLC， which prepared for the further study of antioxidant activity of Shenling Baizhu Powder in vitro. Objective： to determine the content of liquorice flavonoids and ginsenosides in Shenling Baizhu powder by HPLC （reversed phase high performance liquid chromatography）. Methods： the linear range and experimental methods were investigated， and the inhibition of ginsenosides on hydroxyl free radicals was determined. Results： ginsenoside Rg1， quercetin， ginsenoside Re and rutin had significant inhibitory effects on hydroxyl radical in 0.625～5.000 μg， 0.250～1.000 μg， 0.375～3.000 μg and 0.250～1.000 μg， respectively; the average content of rutin was 0.295 mg·g-1; the average content of Ginsenoside Rg1 was 0.193 mg·g-1; the average content of quercetin was 0.2439 The average content of ginsenoside Re was 0.0747 mg·g-1. The antioxidant capacity of Shenling Baizhu Powder was also tested and proved to be more obvious， the inhibition rate of ginseng saponins to hydroxyl free radicals was 79%.

Key words： High-efficiency liquid phase method; Shenling Baizhu Powder; Licorice flavonoids; Ginseng saponins

參苓白術散，別名參術飲，具有補益脾胃的作用，可用于治療食少便溏等癥。高效液相法靈敏度高、出峰快，逐漸用于成分復雜的中藥成分定性定量中^[1]，本次實驗采用的是反相高效液相法測定參苓白術散中人參皂苷和甘草黃酮含量，并研究其有效成分對羥自由基的抑制效果。

近年來，探究參苓白術散方劑中的抗氧化活性成分一直是參苓白術散研究的熱點，而相關研究也證明了參苓白術散方劑中皂苷及黃酮類化合物有較強的抗氧化作用，其含量直接影響了參苓白術散的抗氧化效果。但其含量測定的相關研究較少，HPLC法具有準確性好，靈敏度高的特點，因此我們擬建立一種利用HPLC法同時測定人參皂苷和甘草黃酮含量的方法，為下一步探究參苓白術散的體外抗氧化活性研究做準備。

1? 實驗

1.1? 儀器

紫外-可見檢測器;錐形瓶;移液槍;島津SPD-16高效液相色譜儀紫外-可見檢測器;FA1004N電子天平等。

1.2? 藥材與試劑

參苓白術散粉末;硫酸亞鐵、鐵氰化鉀;人參

皂苷Re標準品、人參皂苷Rg₁標準品、蘆丁標準品、槲皮素標準品均由中國醫藥上海化學試劑公司生產;實驗用水為娃哈哈飲用水等。

2? 方法

2.1? 溶液的制備

2.1.1? 對照品溶液的制備

稱取人參皂苷 Rg₁標準品25 mg， 槲皮素對照品10 mg， 人參皂苷Re標準品15 mg，蘆丁標準品 10 mg溶解稀釋，再 定容，配成蘆丁濃度0.2 mg·mL^-1、 人參皂苷Rg₁0.5 mg·mL^-1、槲皮素0.2 mg·mL^-1、 人參皂苷Re0.3 mg·mL^-1 的混合對照品溶液。

2.1.2? 裝柱

精密稱取參苓白術散15 g，移液槍加入甲醇100 mL，密封，稱定重量，回流3 h，放置至室溫，稱定重量，補足重量，抽濾，移取濾液50 mL，烘干，向剩余部分加5 mL 10%NaOH溶液，加25 mL娃哈哈水，分液漏斗分離4次，合并正丁醇，水洗2次，烘干，向殘渣中加入適量娃哈哈水，通過大孔吸附樹脂柱。洗脫， 蒸干， 通過微孔濾膜濾過。

2.2? 參苓白術散中人參皂苷與甘草黃酮含量的測定

2.2.1? 色譜條件的確定^[2]

選用MERCK PUROSPHER^?STAR C18色譜柱，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min^-1;以乙腈—質量濃度為0.05%磷酸為流動相，每次確保色譜柱柱溫為30 ℃;每次樣品進樣量為20? μL。

2.2.2? 參苓白術散樣品測定

分別精密稱取參苓白術散樣品5份，進樣，出峰后記錄數據，分別計算5份樣品中指標成分的平均含量和RSD %。

2.2.3? 線性范圍的考察

分別精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液，將溶液稀釋至原來的1/2、1/4、1/6、1/8、1/16倍，按2.1色譜條件進行HPLC分析，記錄色譜圖，繪制標準曲線。

2.2.4? 實驗精密度、穩定性與重復性的考察^[3]

精密吸取同一待測溶液，在所確定的HPLC條件下進樣， 并在出峰后記錄數據; 再次通過精密吸取同一待測溶液， 分別于2、 4、 8、 16、 24 h 測定;按上述方法，將參苓白術散待測樣品5份，按如上方法制備，并進樣分析，出峰后記錄數據。

2.2.5? 參苓白術散抗氧化實驗

參照袁元實驗方法^[4]，測定羥自由基的抑制率，

按照下列公式計算參苓白術散的抗氧化能力。

3? 結果

3.1? 4種標準曲線

如表1所示，經測定，蘆丁的標準曲線：

Y=161 485x+10 336，R²=0.999 5;

槲皮素的標準曲線：

Y=74 887x-487.32， R²=0.999 9;

人參皂苷的標準曲線：

Rg₁ Y=354.4x-101.62， R²=0.999 1;

人參皂苷Re? 的標準曲線：

Y=291.37x-89.992， R²=0.998 6 。

上述結果表明高效液相法測定參苓白術散中人參皂苷Rg、槲皮素、人參皂苷Re₁、蘆丁的含量過程較為準確，4種線性方程如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

3.2? 高效液相法測定參苓白術散成分

分析高效液相指紋圖譜可知，參苓白術散中甘草黃酮、人參皂苷與對照品的重合度為90%以上，進行5次重復實驗，各組分含量計算如表2所示。

3.3? 實驗結果考察

如表3所示，對高效液相法測定參苓白術散槲皮素、人參皂苷Re、蘆丁、人參皂苷Rg₁方法進行考察。

3.4? 參苓白術散抗氧化結果

羥自由基為體內具有毒性作用的氧化劑^[5]，清除體內的羥自由基對遺傳物質、多糖等具有一定的保護作用。由圖5所示，實線部分為參苓白術散中的人參皂苷，虛線部分為對照品。人參皂苷對羥自由基的抑制率隨濃度增加而呈上升趨勢，人參皂苷比對照品抗氧化能力更強，參苓白術散中人參皂苷對羥自由基的抑制率為79 %，對照品為64 %。

4? 結 論

梁少雄^[6]等通過指紋圖譜確定參苓白術散中人參皂苷的含量所占比重較大，因此本實驗采用高效液相法測定參苓白術散中的人參皂苷和甘草黃酮的含量^[7]。目前含量測定多采用吸光度法，通過測定回歸方程計算含量。高效液相法靈敏度高、檢測準確、技術成熟^[8]，不僅可以測定含量，還可以根據指紋圖譜、峰面積確定成分^[9]。

人參皂苷是參苓白術散中的有效成分^[10]，分布在人參中，能夠阻止腫瘤分化、調節心律失常、延緩衰老^[11]等，在改善記憶力、提高學習能力等方面作用顯著^[12];甘草黃酮由甘草提取，能夠改善肺部炎癥、治療結腸炎^[13]、減少神經系統損失^[14]等，臨床應用廣泛。

本實驗采用高效液相法測定參苓白術散中人參皂苷的含量，進行線性范圍的考察和實驗方法學研究和藥理實驗^[15]。人參皂苷Rg₁、蘆丁、槲皮素、人參皂苷Re分別在0.625～5.000、0.250～1.000、0.250～1.000、0.375～3.000 μg范圍內顯著;蘆丁的平均質量分數為0.295 5 mg·g^-1;人參皂苷Rg₁平均質量分數是0.193? mg·g^-1; 槲皮素平均質量分數是0.243 9 mg·g^-1;人參皂苷Re平均質量分數是

0.074 7 mg·g^-1。參苓白術散的抗氧化能力經試驗驗證也較為明顯，人參皂苷對羥自由基的抑制率為79%。本實驗僅測定參苓白術散中人參皂苷和甘草黃酮的含量，其優化提取有待進一步研究^[16]。

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基金項目：山東省重點研發計劃（項目編號：2016GSF202003）; 山東中醫藥大學srt項目（項目編號：2019046）。

收稿日期：2020-03-13

作者簡介：王悅（1999-），女，山東省德州人，2021年畢業于山東中醫藥大學，研究方向：中藥學。E-mail：wy6750@qq.com。

通訊作者：高世杰（1977-）， 男， 副教授，博士研究方向： 中藥活性成分分析。E-mail：sys209@ 163.com。