熊果酸類似物的結構改造及其體外抗腫瘤活性研究

佟思淼　孟艷秋

摘 ? ? ?要： 以熊果酸為先導化合物，設計并合成其衍生物并檢測體外抗腫瘤活性。利用熊果酸與各種芳香醛的縮合反應， 采用計算機輔助設計， 對設計的化合物進行篩選;合成分子對接分最高的的12個化合物。對其C-2位Claisen Schmidt 縮合反應， C-3位以及C-28位羧基進行結構改造; 采用MTT法測試目標化合物對人肝癌細胞（HepG2）和人肺癌細胞（A549）的體外抗腫瘤活性。目標化合物對這兩種細胞株的抑制活性均優于母體熊果酸，其中化合物Ⅰ6和Ⅱ4表現出較強的抗腫瘤活性。經結構改造后的熊果酸衍生物具有一定的抗腫瘤活性，值得進一步研究。

關 ?鍵 ?詞：熊果酸;結構改造;抗腫瘤活性;分子對接

中圖分類號：R914.5 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1261-05

Structural Modification and in vitro Antitumor

Activity of Ursolic Acid Analogues

TONG Si-miao， MENG Yan-qiu

（Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang Liaoning 110142， China）

Abstract： Ursolic acid was used as the lead compound， its derivatives were designed and synthesized， and its in vitro antitumor activity was tested. In this paper， the condensation reaction between ursolic acid and various aromatic aldehydes was used to screen the designed compounds by computational aided design.The 12 compounds with the highest molecular score were synthesized.The C-2 Claisen Schmidt condensation reaction， C-3 and C-28 carboxyl groups were modified; The anti-tumor activity of the target compound against human liver cancer cells （HepG2） and human lung cancer cells （A549） in vitro was measured by MTT assay. Inhibitory activity of the target compounds against the two kinds of cell lines was superior to the parent ursolic acid， compoundⅠ6 and Ⅱ4 showed stronger antitumor activity. The structurally modified ursolic acid derivatives have certain antitumor activity and are worthy of further study.

Key words： Ursolic acid; Derivatives; Antitumor activity; Molecular docking

熊果酸是從天然植物中提取出的一種五環三萜類的化合物，具有抗艾滋病[1]、抗白血病[2]、抗糖尿病[3]、抗癌等多種生物學效應，屬于烏蘇烷型五環三萜類化合物，具備五環三萜的典型結構及藥理活性。但熊果酸對癌細胞的細胞毒性較強，不僅僅能夠誘導癌細胞十七進入凋亡期，更能夠抑制癌細胞的增值。熊果酸并未成為抗腫瘤的明星藥物，主要原因是因為其在生物體中的利用程度較低，使得熊果酸的臨床應用和市場發展遭受很大阻礙。為了更有效地解決這些問題，本文通過分子對接，設計并合成了12個化合物，并測得體外抗腫瘤活

性[4-9]。

隨著醫學的發展，越來越多的研究者重視細胞內的發展，也有越來越多的科學家開始利用細胞分離增殖。NF-KB（核因子激活的B細胞的k-輕鏈）是一種存在于所有動物細胞中的蛋白質復合物，其控制轉錄的DNA、細胞因子產生和細胞存活。 NF-KB的不正確調節可能會引起感染性休克，病毒感染和免疫發育不當，也可能會誘發癌癥、炎癥和自身免疫性疾病[10-11]。

1 ?實驗部分

本文采用DS4.0，MVD程序，本文設計的多個化合熊果酸類化合物與NF-kB晶體結構（PDB：3rzf）進行模擬對接，其中C-2位與對硝基苯甲醛、對氯苯甲醛設計連接后的化合物，能與ARG123，LEU386，GLU119和CYS374等關鍵氨基酸與結構中的配體小分子相結合。模擬表明，對接結果表明（圖1-2）化合物和可以很好地嵌入進NF-kB的活性位點，這些表明設計的化合物與靶點具有不錯的親和力。

化合物Ⅰ6與靶點蛋白的分子對接如圖1。

化合物Ⅱ4與靶點蛋白的分子對接如圖2。

以UA為原料，在C-3被氧化的條件下，C-2連接對硝基苯甲醛、對氯苯甲醛，同時C-28位與鹵代烷反應成脂[12-13]。從母核熊果酸UA到合成熊果酸芐啶衍生物包括3個步驟，包括Jones氧化、烷基化、和Claisen Schmidt縮合。在冰水浴的條件下，滴加新配置的的瓊斯試劑，用瓊斯試劑應得到產率接近98%的C-3氧化衍生物UA1;以UA1為原料，用DMF做溶劑，加入鹵代烷1-6，制備了化合物UA2a-UA2f;以UA2a-UA2f為原料加入叔丁醇鉀和甲苯，再加入對硝基苯甲醛或對氯苯甲醛，采用Claisen Schmidt縮合法，得Ⅰ1-Ⅰ6或Ⅱ1-Ⅱ6。路線圖見圖3。

2 ?結果與討論

2.1 ?分子對接

通過MVD等軟件的篩選， 發現熊果酸C-2位引入對硝基苯甲醛和對氯苯甲醛的時，氫鍵的作用力明顯高于母體熊果酸的氫鍵作用力，而其中Ⅰ6與Ⅱ4的氫鍵作用力最大。數據見表1。

2.2 ?化學合成

以熊果酸（UA）為母體，經過氧化、酯化、羥醛縮合反應得到十二個化合物，目標化合物經1H NMR以及MS確定，均屬于新化合物。數據見表2。

2.3 ?抗腫瘤活性實驗

VP-16和阿霉素為陽性對照物，采用MTT法測試目標化合物體外抗腫瘤活性[14-15]。實驗結果表明，合成出的產物對細胞實驗中選取的兩種細胞存在較為明顯的抑制效果，其中化合物I6、II4對人肝癌細胞的IC50值分別為8.72、7.12 μM，化合物I6、II4對人胃癌細胞的IC50值分別為6.85、9.62 μM。將這些化合物對兩種腫瘤細胞與選取的陽性對照藥對腫瘤細胞的IC50作比較，兩者基本相同。由此可以斷定產物具有不錯的抗腫瘤活性。數據見表3。

3 ?實驗部分

3.1 ?中間體的合成

氧代-烏蘇烷型-12-烯-28羧酸（UA1）的合成： 將UA（0.5 g 0.99 mmol）加入100 mL茄形瓶中，隨后加入50 mL丙酮溶解UA，先室溫攪拌0.5 h，使其全部溶解。再將其置于冰水中，加入瓊斯試劑，緩慢滴加。滴加完畢，恢復至室溫，再繼續反應2 h， 薄層色譜法監測反應終點。展開劑：PE/EA=10∶1。監測反應到達終點后，向茄形瓶中加入20 mL異丙醇反應45 min淬滅進行淬滅處理。先加入乙酸乙酯，再加入飽和食鹽水，進行萃取，選取有機相，加入少量無水硫酸鎂及無水硫酸鈉，靜止超過4 h后，抽濾旋轉蒸發柱層析得UA1，產率為90.28%， m.p. 233.0～234.4 ℃。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯（UA2a）的合成：將UA1（0.5 g ， 0.98 mmol）和溴乙烷（2 g， 0.017 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應，薄層色譜法監測反應終點，反應終點后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2a。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯（UA2b）的合成：將UA1（0.5 g ， 0.98 mmol）和溴丙烷（2 g， 0.017 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應，薄層色譜法監測反應終點，反應終點后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2b。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯（UA2c）的合成：將UA1（0.5 g， 0.98 mmol）和溴丁烷（2 g， 0.016 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應，薄層色譜法監測反應終點，反應終點后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2c。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸異丁酯（UA2d）的合成：將UA1（0.5 g ， 0.98 mmol）和溴異丁烷

（2 g， 0.016 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應，薄層色譜法監測反應終點，反應終點后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2d。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯（UA2e）的合成：將UA1（0.5 g， 0.98 mmol）和溴戊烷（2 g， 0.015 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應，薄層色譜法監測反應終點，反應終點后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2e。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯（UA2f）的合成：將UA1（0.5 g， 0.98 mmol）和溴己烷（2 g， 0.017 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應，薄層色譜法監測反應終點，反應終點后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2f。

3.2 ?目標化合物的合成

2-對硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯（Ⅰ1）的合成： 首先將第一步生成的UA2a（0.2 g 0.37 mmol）和對硝基苯甲醛投入50 mL茄形瓶中，并用甲苯將其溶解，加入叔丁醇鉀，在室溫下反應6 h，薄層色譜法監測反應終點。反應介素后，用5%的稀鹽酸酸洗，再用乙酸乙酯萃取。無水硫酸鎂與無水硫酸鈉干燥后，柱層析得到淺黃色固體，洗脫劑：PE/EA=30∶1。產率為63.28%， m.p. 185.1～189.8 ℃。

2-對硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯（Ⅰ2）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2b 和對硝基苯甲醛反應得到粗品，得到淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=30∶1。產率約為68.91%， m.p. 188.8～192.7 ℃。

2-對硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯（Ⅰ3）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2c 和對硝基苯甲醛反應得到粗品，淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=30∶1。產率約為63.11%， m.p. 193.1～195.8 ℃。

2-對硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸異丁酯（Ⅰ4）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2d 和對硝基苯甲醛反應得到，到淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=30∶1。產率約為62.76%， m.p. 192.3～194.8 ℃。

2-對硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯（Ⅰ5）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2e 和對硝基苯甲醛反應得淺黃色固體。洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=30∶1。產率約為60.30%， m.p. 196.3～201.0 ℃。

2-對硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯（Ⅰ6）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2f 和對硝基苯甲醛反應得到淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=40∶1。產率為64.4%，m.p. 198.5～202.1 ℃。

2-對氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯（Ⅱ1）的合成： 首先將第一步生成的UA2a（0.2 g 0.37 mmol）和對氯苯甲醛投入50 mL茄形瓶中，并用甲苯將其溶解，加入叔丁醇鉀，在室溫下反應6 h，薄層色譜法監測反應終點。反應介素后，用5%的稀鹽酸酸洗，再用乙酸乙酯萃取。無水硫酸鎂與無水硫酸鈉干燥后，柱層析得到淡黃色固體，洗脫劑：PE/EA=25∶1，產率為 產率為67.48%， m.p. 188.9～191.6 ℃。

2-對氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯（Ⅱ2）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2b 和對氯苯甲醛反應得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1產率59.03%， m.p. 193.9～196.5 ℃。

2-對氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯（Ⅱ3）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2c 和對氯苯甲醛反應得到淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產率為66.51%，m.p. 198.9～201.7 ℃。

2-對氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸異丁酯（Ⅱ4）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2d 和對氯苯甲醛反應得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產率為64.86%，m.p.197.3～199.5 ℃。

2-對氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯（Ⅱ5）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2e 和對氯苯甲醛反應得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產率為60.51%，m.p. 201.4～205.1℃。

2-對氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯（Ⅱ6）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2f 和對氯苯甲醛反應得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產率為63.65%，m.p. 205.9～208.1 ℃。

基金項目： 國家自然科學基金（項目編號：21372156）;遼寧省創新團隊資助立項（項目編號：LT2017009）;遼寧省教育廳科研項目（項目編號：LFD2017004）;遼寧省重點研發計劃項目（項目編號：2019JH2/10300034）。

收稿日期： 2019-10-13

作者簡介：佟思淼（1994-），錫伯族，女，遼寧沈陽人，碩士研究生，研究方向：藥物化學。E-mail：tsm0115@qq.com。

通訊作者：孟艷秋（1963-）， 女，遼寧義縣人，博士，教授，研究方向：天然化合物有效成分的結構改造及其抗癌活性的研究、新型半合成抗生素的研究、促智藥的研究。

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