miR-1與miR-499對心肌細胞增殖與凋亡調控作用及機制研究

李倩曉 于勤 那榮妹 劉百亭

[摘要] 目的 研究miR-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡中的調控作用及其機制。 方法 通過脂質體2000轉染試劑將miR-1 mimics、miR-499 inhibitor轉染至H9C2心肌細胞。設置空白對照組、H2O2組（未進行轉染的H9C2心肌細胞）、干預組A（miR-1 mimics轉染的H9C2心肌細胞）、干預組B（miR-499 inhibitor轉染的H9C2心肌細胞）、干預組C（miR-1 mimics+miR-499 inhibitor轉染的H9C2心肌細胞）。通過H2O2誘導建立H9C2心肌細胞氧化應激模型。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，Western Blot檢測Bim、Mcl-1蛋白表達水平。 結果 與空白對照組比較，H2O2組細胞增殖顯著降低而細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與H2O2組相比，干預組A、干預組B細胞增殖進一步降低而細胞凋亡率進一步升高，這種改變在干預組C中更加顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。與空白對照組比較，H2O2組Bim蛋白表達水平明顯升高，Mcl-1蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與H2O2組相比，干預組A、干預組B的Bim蛋白表達水平進一步升高，Mcl-1蛋白表達水平進一步降低，這種改變在干預組C中更加顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 miR-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡中發揮重要調控作用，miR-1可能通過上調Bim、下調Mcl-1蛋白表達促進心肌細胞凋亡，miR-499則通過下調Bim、上調Mcl-1蛋白表達抑制心肌細胞凋亡。

[關鍵詞] miR-1;miR-499;調控;心肌細胞;凋亡

[中圖分類號] R587.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）17-0037-04

A study of the regulatory effect of miR-1 and miR-499 on the proliferation and apoptosis of cardiomyocytes and the mechanism

LI Qianxiao1? ?YU Qin2? ?NA Rongmei2? ?LIU Baiting2

1.Department of Cardiology，Zhejiang Integrated Traditional and Western Medicine Hospital，Hangzhou? ?310000，China; 2.Department of Cardiology，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian? ?116001，China

[Abstract] Objective To study the regulatory effect of miR-1 and miR-499 on the proliferation and apoptosis of cardiomyocytes and the mechanism. Methods MiR-1 mimics and miR-499 inhibitor were transfected into H9C2 cardiomyocytes by liposome 2000 transfection reagent. Those groups were set up such as the blank control group， the H2O2 group（H9C2 cardiomyocytes not transfected），the intervention group A（H9C2 cardiomyocytes transfected by miR-1 mimics）， the intervention group B（H9C2 cardiomyocytes transfected by miR-499 inhibitor）， and the intervention group C（H9C2 cardiomyocytes transfected by miR-1 mimic+miR-499 inhibitor）. The oxidative stress model of H9C2 cardiomyocytes was established by H2O2 induction. The cell proliferation was detected by the CCK-8 method， the cell apoptosis was detected by flow cytometer，and Bim and Mcl-1 protein expression levels were detected by Western Blot. Results Compared with that in the blank control group， the proliferation of cells in the H2O2 group was significantly reduced while the apoptosis rate of cells was significantly increased， with statistically significant differences（P<0.05）. Compared with that in the H2O2 group，the proliferation of cells in the intervention group A and the intervention group B further decreased while the apoptosis rate of cells in the two groups further increased， and the correspondent changes were more significant in the intervention group C， with statistically significant differences（P<0.05）. Compared with those in the blank control group，the Bim protein expression level in the H2O2 group significantly increased and the Mcl-1 protein expression level significantly decreased， with statistically significant differences（P<0.05）. Compared with those in the H2O2 group， the Bim protein expression level in the intervention group A and the intervention group B further increased and the Mcl-1 protein expression level further decreased， and the correspondent changes were more significant in the intervention group C，with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion MiR-1 and miR-499 play important regulatory roles in the proliferation and apoptosis of cardiomyocytes. MiR-1 may promote the apoptosis of cardiomyocytes by up-regulating Bim protein expression and down-regulating Mcl-1 protein expression， while miR-499 may inhibit the apoptosis of cardiomyocytes by down-regulating Bim protein expression and up-regulating Mcl-1 protein expression.

[Key words] miR-1;miR-499;Regulation;Cardiomyocyte;Apoptosis

心肌細胞凋亡與心臟疾病密切相關，包括心肌缺血再灌注損傷、缺血性心臟病、心力衰竭、心肌病等[1]。近年來，關于微小RNA（microRNA，miRNA）調控心肌細胞凋亡的研究已成為熱點，為心臟疾病的診治提供了重要方向[2]。本研究將miR-1 mimics、miR-499 inhibitor轉染至H2O2處理的心肌細胞，探討miR-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡過程中的調控作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

大鼠H9C2心肌細胞株，購自中科院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM培養基、0.05%胰酶/EDTA（美國Hycloneo公司）;miR-1 mimics、miR-499 inhibitor、競爭性短核糖核苷酸陰性對照序列（scramble-NC）、miR-499、miR-1和U6引物序列（上海吉凱基因化學技術有限公司）;H2O2、CCK-8、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（中國碧云天試劑公司）;β-actin、Bim、Mcl-1單抗（美國Epitmics公司）;ECL化學發光試劑盒（美國millipore公司）;脂質體2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）;二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（美國Thermo公司）;miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RNase-free ddH2O、逆轉錄試劑盒（德國QIAGEN公司）。RT-PCR檢測儀（美國ABI公司），流式細胞儀（美國BD公司），酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 細胞培養

配置含10%胎牛血清的DMEM培養基，加入H9C2心肌細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每隔2～3 d細胞傳代1次。在實驗前24 h取對數生長期的H9C2心肌細胞換液備用。

1.3 細胞分組及轉染

將培養好的H9C2心肌細胞分為空白對照組、陰性對照組、miR-1 mimics組、miR-499 inhibitor組。除空白對照組外，其余三組H9C2心肌細胞分別采用隨機合成的miRNA片段、miR-1 mimics片段、miR-499 inhibitor片段通過脂質體2000轉染試劑進行轉染，濃度均為200 nm，處理時間均為6 h。轉染結束后將細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養，48 h后收集細胞。

1.4 RT-PCR檢測轉染情況

采用miRNeasy Serum/plasma Kit試劑盒提取血清RNA，并檢測RNA的純度。采用逆轉錄試劑盒將miRNA逆轉錄為特定的cDNA，并置于-80℃冰箱保存備用。RT-PCR反應：應用制備好的cDNA作為模板，分別配置空白對照組、陰性對照組、miR-1 mimics組、miR-499 inhibitor組反應管，以U6作內參。采用ABI 7500軟件分析熔解曲線，用2-△Ct計算miRNA基因相對表達量。

1.5 實驗分組及H2O2處理

設置空白對照組、H2O2組（未進行轉染的H9C2心肌細胞）、干預組A（miR-1 mimics轉染的H9C2心肌細胞）、干預組B（miR-499 inhibitor轉染的H9C2心肌細胞）、干預組C（miR-1 mimics+miR-499 inhibitor轉染的H9C2心肌細胞）。除空白對照組外，其余四組H9C2心肌細胞均采用200 μmol/L的H2O2處理6 h。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖情況

取對數生長期的H9C2心肌細胞，接種到96孔板中（1×104個細胞/孔），置于37℃、5%CO2培養箱中，培養24 h，待細胞貼壁后，將H2O2處理后的各組細胞加入貼壁均勻的96孔板中，用CCK-8進行處理后，繼續置于37℃、5%CO2培養箱中。孵育2 h后，測定各組細胞光密度（optical density，OD）值。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

取H2O2處理后的各組細胞，經PBS洗滌后，消化，離心，收集細胞。在收集到的細胞沉淀中加入200 μL binding buffer并吹打成單細胞懸液，再分別加入濃度為250 μg/mL的Annexin V-FITC和PI試劑各5 μL，避光室溫下反應5～15 min，在1 h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 Western Blot檢測Bim、Mcl-1蛋白表達水平

取H2O2處理后的各組細胞，加入裂解液處理30 min，收集蛋白并用BCA法測定蛋白濃度，煮沸10 min使蛋白變性，上樣，按20 μg/泳道蛋白量經12%SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入β-actin、Bim、Mcl-1特異性抗體（均按照1：1000稀釋），4℃孵育過夜。次日用PBS-T液洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h后，電化學發光（Electro-chemi-luminescence，ECL）顯影，采用圖像分析軟件測定目的條帶灰度值，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）條帶灰度值作為對照進行校正，分別計算出各樣本相對表達量。計算方法：目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染結果比較

與空白對照組和陰性對照組比較，miR-1 mimics組miR-1表達明顯升高，miR-499 inhibitor組miR-499表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。空白對照組與陰性對照組間miR-1與miR-499表達均無顯著差異（P>0.05）。見表1。

注：與空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.05;與空白對照組比較，▲P>0.05

2.2 各組心肌細胞增殖檢測結果比較

與空白對照組比較，H2O2組細胞增殖顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與H2O2組相比，干預組A、干預組B細胞增殖進一步降低，這種改變在干預組C中更加顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

注：與空白對照組比較，*P<0.05;與H2O2組比較，#P<0.05

2.3 各組心肌細胞凋亡檢測結果比較

與空白對照組比較，H2O2組細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與H2O2組相比，干預組A、干預組B細胞凋亡率進一步升高，這種改變在干預組C中更加顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

注：與空白對照組比較，*P<0.05;與H2O2組比較，#P<0.05

2.4 各組心肌細胞Bim、Mcl-1蛋白表達水平比較

與空白對照組比較，H2O2組Bim蛋白表達水平明顯升高，而Mcl-1蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與H2O2組相比，干預組A、干預組B的Bim蛋白表達水平進一步升高，而Mcl-1蛋白表達水平進一步降低，這種改變在干預組C中更加顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

注：與空白對照組比較，*P<0.05;與H2O2組比較，#P<0.05

3 討論

心肌細胞凋亡由氧化應激、缺血、缺氧、負荷過重、再灌注損傷等誘導[3]。心肌細胞凋亡機能異常是多種心臟疾病發生的重要機制[4]。細胞凋亡經典通路主要包括線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路[5]。B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因家族是一類重要的凋亡調控蛋白，在線粒體凋亡通路中具有重要調節作用[6-8]。Bcl-2基因家族分為抗凋亡亞家族、促凋亡亞家族和僅含BH3結構域的BH3-only亞家族[9]。Bcl-2相互作用細胞凋亡調節因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）是僅含BH3結構域的BH3-only亞家族成員之一，與促凋亡亞家族成員高親和力結合，發揮促凋亡作用[10]。髓細胞白血病基因-1（myeloid cell leukaemia-1，Mcl-1）是抗凋亡亞家族成員之一，可調控細胞凋亡、分化和細胞周期[11]。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中內源性表達的小分子非編碼單鏈RNA，幾乎參與調控人類生長發育的各個階段[12，13]。miRNA在轉錄水平通過與靶基因mRNA特定序列互補結合，阻止靶基因mRNA翻譯或誘導其剪切，從而在基因調控中發揮重要作用，參與各種生物學過程和疾病的發生發展[14，15]。miRNA在心臟疾病的病理過程中具有重要調節作用[16]。研究發現，miRNA可作為心臟疾病早期篩查的生物標志物[17]。由于miRNA可同時調控細胞某一信號通路上與疾病相關的多個基因表達，因此對miRNA進行干預有望成為更理想的治療方法[18]。miR-499是與心肌細胞分化密切相關的miRNA，在心肌細胞中特異表達[19，20]。miR-1在調節心肌細胞增殖、心臟節律性、心臟電傳導等過程中具有重要作用[21]。本研究檢測了miR-1 mimics、miR-499 inhibitor轉染后心肌細胞增殖與凋亡情況，結果表明，上調miR-1表達或抑制miR-499表達后，心肌細胞增殖降低，而心肌細胞凋亡率升高。當兩者同時進行干預后，心肌細胞增殖進一步降低，而心肌細胞凋亡率則進一步升高。通過檢測促凋亡蛋白Bim與抗凋亡蛋白Mcl-1，發現轉染miR-1 mimics、miR-499 inhibitor心肌細胞，Bim蛋白表達水平明顯升高，Mcl-1蛋白表達水平明顯降低，而聯合干預組Bim蛋白表達水平升高幅度及Mcl-1蛋白表達水平降低幅度更為顯著，提示miR-1可能是通過上調Bim、下調Mcl-1蛋白發揮促進心肌細胞凋亡作用，而miR-499則通過下調Bim、上調Mcl-1蛋白發揮抑制心肌細胞凋亡作用。

總而言之，miRNA的發現為心臟疾病的診斷與治療提供了一個新的研究方向，但目前相關機制研究仍處于起步階段，尚有待今后進一步深入探索。

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（收稿日期：2020-03-11）