雷公藤內酯醇對荷卵巢癌大鼠的抑瘤效應及其對免疫系統的影響

張浩　馬犇　程楊

摘要 目的：研究雷公藤內酯醇（TP）用于荷卵巢癌大鼠的抑瘤效應及其對免疫系統的影響。方法：選取性SD大鼠作為實驗動物，皮下注射卵巢癌細胞后得到荷卵巢癌大鼠，分為腹腔注射生理鹽水的對照組、低劑量TP組、中劑量TP組、高劑量TP組。藥物干預后測定腫瘤的質量和體積、腫瘤組織中抑癌基因的表達量、外周血中免疫細胞因子的水平。結果：低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠的腫瘤質量與體積、外周血中白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-17（IL-17）、轉化生長因子β1（TGF-β1）的水平均明顯低于對照組，腫瘤組織內PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量以及外周血中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平均明顯高于對照組且TP劑量越大，腫瘤質量與體積、外周血中IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低，腫瘤組織內PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量以及外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高。結論：TP用于荷卵巢癌大鼠具有顯著的抑瘤效應，能夠抑制腫瘤生長、增加抑癌基因表達并調節抗腫瘤免疫應答。

關鍵詞 卵巢癌;雷公藤內酯醇;荷瘤鼠;抑癌基因;免疫應答

Antitumor Effects of Triptolide on Tumor Ovarian Cancer Bearing Rats and Effects of Triptolide on Immune System

ZHANG Hao，MA Bei，CHENG Yang

（ Department of Gynaecology，the First People′s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510180，China）

Abstract Objective：To study the antitumor effects of Triptolide （TP） used in rats with ovarian cancer and its influence on the immune system.Methods：Female SD rats were selected as experimental animals，and ovarian cancer-bearing rats were obtained after subcutaneous injection of ovarian cancer cells.They were divided into a model group，a low-dose TP group，a middle-dose TP group，and a high-dose TP group injected with physiological saline.After drug intervention，the weight and volume of the tumor，the expression of tumor suppressor genes in the tumor tissue，and the content of immune cytokines in the peripheral blood were measured.Results：Tumor weight and volume，interleukin-4 （IL-4） in peripheral blood，interleukin-17 （IL-17），and transforming growth factor β1 （TGF-β1） in rats in the low-dose，middle-dose，and high-dose TP groups were significantly lower than the model group，and the expression of PTEN，ST7L，Bax，TIMP1，E-cadherin mRNA in tumor tissues and interferon-γ （IFN-γ） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in peripheral blood were significantly higher than the model group.The greater the TP dose，the lower the tumor weight and volume，and the content of IL-4，IL-17，and TGF-β1 in the peripheral blood，the higher the mRNA expression of PTEN，ST7L，Bax，TIMP1，E-cadherin in the tumor tissue，and the higher the content of IFN-γ and TNF-α in peripheral blood.Conclusion：TP has a significant tumor suppressing effects on ovarian cancer-bearing rats，which can inhibit tumor growth，increase tumor suppressor gene expression and regulate anti-tumor immune response.

Keywords Ovarian cancer; Triptolide; Tumor bearing mice; Tumor suppressor gene; Immune response

中圖分類號：R284;R711文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.011

卵巢癌是臨床上常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，早期診斷難度大，確診時多已發展至中晚期，通過細胞減滅術、放化療雖然能夠在一定程度上殺傷癌細胞、控制腫瘤病情發展，但整體預后并不理想、5年生存率不足30%[1-2]。近年來，越來越多的學者致力于探尋卵巢癌質量的新藥物。雷公藤內酯醇（TP）是從中藥材雷公藤中分離得到的活性成分，屬于二萜內酯類化合物，具有廣泛的抗腫瘤及免疫調節活性[3]。已有細胞實驗研究證實，雷公藤內酯醇對離體培養卵巢癌的增殖具有顯著抑制作用[4]，但雷公藤內酯醇是否能夠在活體卵巢癌病灶中發揮抗腫瘤作用仍不明確。我們以荷卵巢癌大鼠為研究模型，具體分析了雷公藤內酯醇的抑瘤效應及其對免疫系統的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取由大學實驗動物中心提供雌性SD大鼠，2月齡、體質量220～300 g，動物許可證號：SYXK（粵）2015-0104。飼養環境：溫度（23±1.3）℃，濕度（50±2）%，12 h/12 h晝夜交替。

1.1.2 藥物

雷公藤內酯醇購買于美國Sigma公司，批號：283922。

1.1.3 試劑與儀器

卵巢癌NUTU-19細胞株（ATCC公司，美國，貨號：5346-2），細胞培養所用RPMI1640培養基（批號：46522）、胎牛血清（貨號：Ta3695）、胰蛋白酶（貨號：694358）均購于美國Hyclone公司，基因mRNA表達量檢測所用試劑盒（北京康為世紀公司，批號：1675-11），酶聯免疫吸附試驗（Elisa）試劑盒（上海西唐生物公司，批號：436-3）。

1.2 方法

1.2.1 分組及荷卵巢癌大鼠制作

荷卵巢癌大鼠隨機分為對照組、低劑量TP組、中劑量TP組、高劑量TP組，復蘇卵巢癌NUTU-19細胞株后用含有10%胎牛血清的RMPI1640進行培養，擴增后用胰蛋白酶進行消化，重懸細胞后加入適量RMPI1640、將細胞密度調節至2×107/mL;取0.2 mL細胞懸液、接種在大鼠右側腋窩的皮下，繼續喂養5～7 d后形成0.4 cm×0.4 cm的腫瘤病灶，用于后續分組及藥物干預。

1.2.2 干預方法

對照組每天給予生理鹽水2 mL腹腔注射，低劑量TP組、中劑量TP組、高劑量TP組分別按照0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg的劑量將雷公藤內酯醇溶于2 mL生理鹽水并進行腹腔注射。4組大鼠均連續給藥5 d。

1.2.3 檢測指標與方法

腫瘤質量與體積的測定：給藥5次后，第2天采用頸椎脫臼法處死大鼠，分離腫瘤組織并在電子天平上稱重，而后測量腫瘤組織的長徑a和短徑b、按照公式ab2/2計算腫瘤體積。

腫瘤組織中基因 mRNA表達量的測定：完成腫瘤質量與體積的測定后，按照試劑盒Ultrapure RNA Kit進行操作并提取腫瘤組織中的RNA，而后按照試劑盒SuperRT One Step RT-PCR Kit配置反轉錄體積、合成cDNA;取cDNA與2×Taq Plus MasterMix反應液及引物混合為PCR反應體系，按照95 ℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72 ℃ 25 s的程序重復40次，得到反應曲線及循環閾值（Ct）后按照公式2-△△Ct計算基因的mRNA表達量。PCR引物序列及退火溫度見表1。

外周血中細胞因子的測定：處死大鼠后，收集外周血標本，采用Elisa試劑盒測定干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-17（IL-17）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）的水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，組間計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用完全隨機設計的方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠的腫瘤質量與體積 與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠的腫瘤質量與體積均明顯降低且TP劑量越大，腫瘤質量與體積越低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2 4組大鼠腫瘤組織內抑癌基因的表達量 與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠腫瘤組織內PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量均明顯升高且TP劑量越大，腫瘤組織內PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量越高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3 4組大鼠外周血中免疫細胞因子的水平 與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α的水平均明顯升高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平均明顯降低且TP劑量越大，外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

卵巢癌的早期癥狀不典型、診斷率較低，多數患者確診時已經發展至中晚期并錯過了根治性切除的時機，此時只能選擇細胞減滅術、放化療等治療手段來殺傷癌細胞、延緩腫瘤的病程，但整體預后不理想且5年生存率較低。近年來，中藥材的抗腫瘤作用受到了越來越多的關注，多種中藥材被證實具有抗腫瘤活性，其中TP是中藥材雷公藤中的活性提取物，在多種惡性腫瘤細胞中被證實具有抗腫瘤、免疫調節活性[5-6]。細胞實驗研究結果表明，TP能夠明顯降低離體培養卵巢癌細胞的增殖活力，能夠在離體水平發水抗腫瘤效應[7]，但TP在卵巢癌活體病灶內的抗腫瘤效應尚未見明確報道。在本研究中，為了明確TP在卵巢癌活體病灶內的抑瘤效應，我們采用皮下注射卵巢癌細胞的方式建立了荷卵巢癌大鼠模型并以該模型為研究對象，通過腹腔注射TP的方式進行干預，由藥物干預后腫瘤質量和體積的分析可知：TP組大鼠的腫瘤質量與體積均明顯降低且TP劑量越大，腫瘤質量與體積越低。這一結果說明TP在荷卵巢癌大鼠體內具有抑瘤效應，能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤的質量和體積。

在卵巢癌的病理進程中，局部病灶內抑癌基因表達缺失與癌細胞增殖、侵襲活力的增強有關，多種抗腫瘤藥物能夠以抑癌基因為作用表達、通過激活抑癌基因來抑制癌細胞的增殖、侵襲。PTEN、ST7L、Bax是與卵巢癌細胞凋亡直接相關的抑癌基因，PTEN的編碼產物具有磷酸酶活性，在催化MAPK、PI3K、AKT等信號分子發生去磷酸化的基礎上抑制信號通路活化、誘導細胞發生凋亡[8];ST7L基因與Wnt2成簇表達，表達產物能夠使細胞周期發生停滯并迅速進入凋亡程序[9-10];Bax基因的編碼產物屬于Bcl-2家族，能夠在線粒體膜上拮抗Bcl-2的活性并增加線粒體內細胞色素C的釋放，進而通過細胞色素C的活性來介導細胞凋亡的級聯放大[11]。TIMP1、E-cadherin是與卵巢癌細胞侵襲密切相關的抑癌基因，前者通過拮抗多種蛋白酶水解細胞外基質的活性來抑制癌細胞侵襲，后者通過增強細胞間極性及黏附性來抑制癌細胞侵襲[12-13]。本研究對荷卵巢癌大鼠腫瘤組織中上述抑癌基因表達的分析發現：TP組大鼠腫瘤組織內PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量均明顯升高且TP劑量越大，腫瘤組織內PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量越高。說明TP在荷卵巢癌大鼠體內具有增加抑癌基因表達的效應，通過改變抑癌基因的表達能夠誘導癌細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲，進而發揮抑制腫瘤生長的抑瘤效應。

當卵巢癌進展至中晚期后，患者體內存在顯著的抗腫瘤免疫應答紊亂，癌細胞容易發生免疫逃逸并不斷生長。CD4+T細胞是在體內發揮抗腫瘤免疫應答效應的重要細胞，能夠分泌不同的免疫細胞因子并在抗腫瘤免疫應答中發揮不同作用[14]。Th1是介導細胞免疫的CD4+T細胞亞群，通過分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子來殺傷癌細胞[15];Th2是介導體液免疫的CD4+T細胞亞群，通過分泌IL-4等細胞因子一方面能夠使B細胞發生活化并參與體液免疫，另一方面也能使Th1的分化受到抑制并削弱Th1所介導的抗腫瘤效應[16];Th17是特異性分泌IL-17的CD4+T細胞亞群，該細胞亞群所分泌的IL-17具有促進腫瘤細胞遷移、侵襲的效應[17];Treg是具有免疫抑制活性的CD4+T細胞亞群，通過分泌TGF-β1等抑制性細胞因子來使機體的抗腫瘤免疫應答活性減弱[18]。本研究對荷卵巢癌大鼠外周血中上述免疫細胞因子水平的分析發現：TP組大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α的水平均明顯升高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平均明顯降低且TP劑量越大，外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低。這一結果說明TP在荷卵巢癌大鼠體內具有調節抗腫瘤免疫應答的作用，通過增加Th1細胞因子的分泌并減少Th2、Th17、Treg細胞因子的分泌來增強抗腫瘤免疫應答。

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（2018-08-22收稿 責任編輯：張雄杰）

基金項目：廣東省醫學科研課題（A2013588）作者簡介：張浩（1978.01—），男，本科，副主任醫師，研究方向：中醫婦科腫瘤臨床工作，E-mail：zhalidortor@163.com