硝化細菌工業化快速富集

劉宗躍，楊宏，王少倫，王佳偉

（北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室，北京100124）

引 言

硝化細菌大多數屬于好氧自養型，相比于反硝化細菌等異氧菌，其世代時間長、增殖速率慢，易受到溫度、溶解氧（DO）、pH、毒性物質的影響[1-2]。硝化細菌的這些特性會直接影響到氨氮廢水處理出水的穩定性。提高硝化細菌濃度來強化處理效果是一種有效途徑。通過包埋固定化技術將特定的功能菌群固定起來，能真正實現污水處理有效功能菌相對較高濃度的存在[3]，從而可解決活性污泥法單泥系統中各菌群相互制約、相互影響，導致各功能菌群不能充分發揮最佳生化性能的問題。同時針對不同的污水類型包埋固定化可以實現定性定量的投加[4]。因此，快速有效地篩選、馴化出性能優良的硝化細菌種群是通過包埋技術實現生物脫氮的有效途徑。

現階段，國內外有關硝化細菌中試規模的研究，常見的是采用活性污泥富集硝化污泥。冬季污水廠出水總氮濃度達標困難，被富集的硝化細菌直接接種到主流工藝后硝化能力會提高，氮的去除效率也會隨之提高[5]。但隨著后期運行時間的推移，富集的硝化細菌難以在系統中穩定存在，需要不斷地補加污泥。通過富集培養后高效的硝化細菌作為包埋固定化的菌源，對含氮污廢水實現定量投加，不僅能增加硝化細菌的濃度而且能穩定存在，并且較少地產生剩余污泥[6]。

本實驗通過工業級生物反應器探究快速培養硝化細菌的技術途徑，為包埋固定化技術提供高效、穩定的硝化細菌菌源。

1 材料與方法

1.1 污泥富集培養材料與方法

本實驗采用大型的工業級生物反應器，通過PCL 控制實驗參數（pH、DO、溫度）進行硝化細菌富集培養探究。

營養物質采用實驗室人工配制原液。由于反應器有效容積過大，原藥箱配制高氨氮溶液，初始氨氮濃度為50 mg·L-1。組分組成（高濃度氨氮按倍數增加）及常量元素質量濃度：NH4Cl 156.5 mg·L-1，NH4H2PO442.64 mg·L-1，MgSO4·7H2O 20 mg·L-1，CaCl210 mg·L-1。pH 用Na2CO3溶液調節，每1 L 水中加入100 g Na2CO3，即堿水濃度100 g Na2CO3·L-1。

微量元素組分組成：ZnSO4·7H2O 0.12 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.12 mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.15 mg·L-1，FeCl3·6H2O 1.5 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.03 mg·L-1，NiCl2·6H2O 0.12 mg·L-1，Mn2SO4·H2O 0.12 mg·L-1。每1 L藥箱原水加入1 ml的微量元素。

1.2 實驗裝置、運行工況與培養方式

1.2.1 實驗裝置 污泥富集裝置示意圖見圖1。實驗原始污泥取自實驗室原有經過馴化的硝化污泥（由高碑店污水廠A2O 回流活性污泥馴化），該污泥閑置20余天但仍具有硝化活性。

圖1 污泥富集裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sludge enrichment device

1.2.2 運行工況 反應器總容積為3000 L，有效容積控制在2500 L。培養分三個階段進行，各階段工況參數見表1。

表1 各階段運行工況Table 1 Operation conditions of each stage

1.2.3 培養方式 整個培養過程采用氨氮流加-間歇式運行[7]，分為反應、沉淀、排水、進水。反應階段氨氮流加進藥、堿箱自動加堿。為了控制反應器有效體積2500 L 左右和FNA(游離亞硝酸鹽)不至于抑制AOB（氨氧化細菌）、NOB（亞硝酸鹽氧化細菌），需要定期排水，排水周期根據不同氨氧化效率下產生FNA 值進行調整。排水過程中通過加清水再排水程序對污泥進行清洗。適當排除部分污泥以淘洗非目標菌群而篩選AOB 菌群，以及適當控制AOB污泥齡[7]。

（1）反應：氨氮流加、PCL 自控柜控制計量泵自動加堿、溶解氧通過閥門控制氣量。

（2）沉淀：沉淀時間30 min（為保證硝化污泥充分沉淀，防止硝化細菌被排出）。

（3）排水：將沉淀上清液經高位排水管排出反應器，容積排至500 L左右。排水時間30 min。

（4）進水：排水完成后將水加至沒過探頭（pH、DO、溫度），此時反應器體積為1500 L，溫度通過發酵罐的加熱水套水浴加熱到25℃后開始運行。

1.3 分析項目及檢測方法

采用Illumina HiSeq2500PE250高通量測序平臺對樣品進行測序。包括DNA 提取與PCR 擴增，DNA文庫定量、測序和生物多樣性分析[9]。

2 結果與討論

2.1 硝化細菌富集結果分析

圖2中進水氨氮濃度為藥箱平均每小時進入反應器中的氨氮濃度（經過體積折算）。由圖2可以看出，在A階段初期硝態氮生成比例較高，亞硝態氮積累率較低。隨著后期培養時間的增加，亞硝態氮生成比例逐漸變高。在B階段硝態氮生成量開始出現下降，亞硝態氮生成量隨著進水氨氮濃度的升高而逐漸升高，在B 階段末期亞硝態氮積累率處于一個較高的水平上。C 階段處于規律排泥階段，硝態氮生成量處于一個較穩定的狀態。從整個培養時期來看，運行階段的出水氨氮控制在30 mg·L-1以下，進水負荷的濃度根據氨氧化效率的變化而改變。硝態氮生成量呈現一個先增加后下降趨勢，亞硝態氮生成量不斷上升。推測原因：隨著氨氧化效率的升高，反應器體系里亞硝態氮的積累量逐漸增多，反應周期結束排水時平均亞硝態氮濃度達1500 mg·L-1，對應FNA 為0.031[10]，該濃度下FNA 已經對NOB 產生抑制作用。B 階段末期通過排泥，可以有效控制AOB與NOB之間污泥齡的差異。

圖2 各階段進出水NH4+-N和NO2--N、NO3--N生成量變化曲線Fig.2 Change curve of NH4+-N,NO2--N and NO3--N production in the inflow and outflow water of each stage

在圖3 中可以看出在A 階段末第24 天，污泥濃度為3000 mg·L-1左右時，污泥增長速率最快，與其相對應的氨氧化速率也呈現較快的增長。進入B、C階段后污泥增長速度較A 階段開始減緩，而B 階段末期第60 天開始取泥。在開始取泥后的幾天發現氨氧化速率有較高的增長，說明適度排泥可以實現AOB的進一步篩選。在第130天污泥濃度重新降低至2820 mg·L-1。觀察其污泥濃度又呈現較高速率的增長，可以驗證在A 階段末期（第24 天）為污泥快速增長期。當反應器中污泥濃度較高時，由于其基數大，單位時間產生新鮮污泥的量就越多，但用藥量也就越多。綜合考慮污泥增速和培養成本，選擇污泥濃度為3000～4000 mg·L-1作為最佳細菌增長控制濃度。其穩定運行階段每天產出干泥量為0.3 kg·(m3·d)-1，濕泥（含水率85%）為2 kg·(m3·d)-1。

圖3 氨氧化速率及污泥濃度增長曲線Fig.3 Ammonia oxidation efficiency and sludge concentration growth curve

對0～60 d 污泥濃度（取對數值）與培養時間作圖發現其近似符合單種群增長的“S”形曲線。硝化細菌最大增殖速率與自養型細菌增殖動力學有關。由于影響菌群增長的因素眾多,而且它們對增長過程的影響也不同步,所以菌群細胞特征為一隨時間而變化的多元函數, 是一個不斷變化的動態體系，由于菌群組成的異質性,動力學過程的分析也遠較化學反應系統復雜[11-14]。logistic 方程、Monod 方程以及Michaelis-Menten 方程都可用于描述“S”形增長過程[15]，其中μmax（最大比增長速率）是最關鍵的一個參數。它比半飽和常數KNH對于廢水的濃度更敏感,而且它能決定防止出現硝化菌流失的最短污泥停留時間[16-17]。溫度、溶解氧、起始污泥濃度、體系中氨氮濃度以及有機物均會對自養細菌最大增長速率產生重要影響[18]。

由圖4 可知，A 階段較B、C 階段比氨氧化速率和亞硝態氮積累率增速較快。說明從啟動初期到結束24 d 內，原始污泥經歷了快速篩選過程，硝化污泥在整個污泥系統中快速占據了主導地位。而B階段隨著污泥濃度的增高，經過繼續培養比氨氧化速率和亞硝態氮積累率增長速度放緩。C 階段經過不斷的取泥過程，比氨氧化速率和亞硝態氮積累率呈現緩慢增長并穩定下來。通過對比B、C 階段的培養數據發現，150 d 較60 d 的比氨氧化速率、亞硝態氮積累率同比增長率分別為9.5%、2.2%。而通過下文高通量數據發現兩者高通量中AOB 占比分別為27%和52%，同比增長率為92%。說明隨著培養時間的延長，污泥濃度的增加及規律的排泥雖然使得AOB 在生物群落中占比大大增加，但在氨氧化速率和亞硝態氮積累率上并沒有得到快速響應。因此通過較短的時間對原始污泥進行馴化，不僅能夠實現硝化細菌在生物群落中快速占據一定的比例，且培養經濟性最佳。

圖4 比氨氧化速率和亞硝態氮積累率變化曲線Fig.4 Change curve of specific ammonia oxidation efficiency and nitrite nitrogen accumulation rate

2.2 高通量測序結果分析

2.2.1 菌群聚類及多樣性分析 L0～L3 為系統運行時第0 d、60 d、150 d、180 d 的污泥樣。四組樣品的16S rRNA基因文庫高通量測序，污泥起始樣（L0）與富集培養后的污泥樣（L1、L2、L3）Alpha 多樣性指標結果見表2。

表2 Alpha多樣性指標計算結果Table 2 Calculation results of Alpha diversity index

經歷一段時間的培養篩選，從ACE 指數下降可以看出污泥系統中微生物種群的豐度大幅度下降。Shannon 指數由最初的3.44 降至2.54，Simpson 指數由最初的0.12 上升至0.30，說明經過定性篩選適應環境的硝化細菌大量增殖，菌群的多樣性和均勻性在降低。功能菌群在系統中逐步占據主導地位并且穩定下來。Wittebolle 等[19]指出微生物種群的均勻性越高，該系統在應對環境沖擊時的功能穩定性越好。但因包埋固定化技術可以實現對菌群的良好保護，因此即使在功能菌群占比高、整體菌群均勻性低的情況下仍能應對復雜水質及沖擊負荷。而且能夠充分發揮優勢功能菌群的作用，維持系統穩定性[20]。

2.2.2 硝化功能菌群變化分析 圖5～圖8 分別對應L0～L3 屬層次污泥樣本豐度餅圖。L0 樣品中未分類菌種占比高達80.11%，推測原因可能是污泥經過一個較長時間放置長期處于缺氧厭氧狀態使得其中的雜菌滋生。 具有硝化作用的菌屬Nitrosomonas 僅占7.75%，NOB 未檢出。其他菌屬多以反硝化功能的兼性厭氧菌、芽單孢桿菌屬和其他雜菌構成。經歷A、B 兩個階段的培養L1 樣本高通量顯示，亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)已變成反應器體系中第一大優勢菌種占比27.7%，硝化桿菌（Nitrobacter）占比2.67%。

圖5 原始污泥的種群分布Fig.5 Population distribution of original sludge

圖6 60 d的種群分布Fig.6 Population distribution in 60 days

圖7 150 d的種群分布Fig.7 Population distribution in 150 days

圖8 180 d的種群分布Fig.8 Population distribution in 180 days

C 的階段末期和后期運行對應的L2、L3 樣本顯示，亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas(AOB)占比分別是52.33%、56.59%。硝化桿菌屬Nitrobacter（NOB）占比分別是1.15%、0.67%。通過繼續培養并不斷產泥過程，發現AOB 不僅能占據主導地位并且占比逐步變高。分析有以下原因：（1）后期pH 維持著較高的水平8.0以上（普遍認為AOB比NOB適宜生長pH條件較高，適宜AOB生長的pH范圍為7.0～8.5，NOB為6.0～7.5[21-22]）。（2）隨著后期污泥濃度增大，氨氧化速率變高，雖然排水周期縮短，但水中亞硝酸鹽濃度積累過高，FNA 對NOB 逐漸產生了抑制（游離亞硝酸完全抑制NOB 和AOB 生長的濃度分別為0.02 mg·L-1和0.4 mg·L-1[23-25]，反應器排水時平均亞硝酸鹽濃度1500 mg·L-1，此時FNA=0.031 大于0.02[26]）。（3）排泥的過程就是AOB 篩選的過程。由于氨氧化細菌（AOB）較硝化細菌（NOB）世代時間短[27]、繁殖速率快，所以規律快速的排泥使細菌得到了篩選。

通過對比三個階段的高通量和數據分析發現，隨著培養繼續污泥濃度的增加及規律的排泥在硝化效率和積累率上并沒有得到快速響應。從實際培養效果來看，一方面一味地提升AOB 的占比使其成為菌群結構中絕對優勢菌屬并不能相應地帶來較好的比氨氧化速率。這可能與菌群之間的協同、共生作用有關。有研究表明污水生物處理工藝(包括硝化工藝)作為多物種共存的復雜生態系統，其所表現出的系統功能不僅受特定功能菌群的影響，還與共存的其他物種有關[28-29]。另一方面反復的篩選需要較長的培養時間和較大的經濟成本。

2.2.3 微生物種群結構變化 選取污水廠2個活性污泥樣分別命名為H1、H2，圖9中分別從門、綱和屬水平分析了活性污泥與各培養階段的硝化污泥微生物種群結構變化。6 個樣本中相對豐度大于1%的菌門類共檢測到13 個，其中變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為各個樣本的主要優勢菌門。盡管從門種類上來看各樣本種群組成基本相同，但從單個門類的相對豐度和構成來看存在明顯的差異。L0 中擬桿菌門為其第一大類優勢菌門，相比其他樣品其占比高達49.95%。觀察其對應的綱水平下發現鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)為主要貢獻者。研究表明，Sphingobacteria 作為一種能夠產生鞘脂的細菌，包括聚糖菌等細菌[30]。正由于其特殊的鞘脂結構和體內富集的PHA 等高能物質的存在，其對于饑餓環境有著較強的抵抗能力，故而可以在長期饑餓環境中得以生存。H1、H2 作為平行樣，無論從門、綱和屬上物種相對豐度差別不大。而各個樣本從門、綱種類上種群組成相同可印證它們之間的同源性。后期培養過程中由于定向篩選的原因而導致種群豐度上的明顯差異，這一點從各個樣本屬層次的差異性更能看出。經過24 d 培養L1 樣本與L0相比，擬桿菌門（Bacteroidetes）有大幅度下降。表現在綱水平分別是鞘脂桿菌綱(Sphingobactera)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、黃桿菌綱(Flavobacteria)等異養菌的大量減少。說明經歷短暫的好氧底物投加即可以實現對異養菌的快速淘洗。與初期L0樣本相比，L2、L3 樣本在變形菌門（Proteobacteria）和鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)水平上分別有平均30%、37%增長。 這主要由屬水平上亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）增長的結果導致。從整個培養時期的種群結構變化發現，通過工業級生物反應器定性短期篩選可以實現特定菌門、特定菌屬的優勢富集。

圖9 污泥樣本中含量大于1%的細菌序列的相對豐度（門、綱和屬水平）Fig.9 Relative abundance of bacterial sequences(at the level of phylum,class and genus)containing more than 1%in sludge samples

3 結 論

（1）通過工業級反應器富集培養硝化細菌數據結果發現，在起始階段末期24～27 d，污泥濃度3000～4000 mg·L-1左右時污泥增長速率最快、產泥經濟性最佳。其穩定運行階段每天產出干泥量為0.3 kg·(m3·d)-1，濕泥（含水率85%）為2 kg·(m3·d)-1。

（2）從整個培養過程中的高通量在不同水平上的變化可以說明通過生物反應器定性短期篩選可以實現特定菌門、特定菌屬的優勢富集，并且以較短時間即可實現功能菌篩選及產出。

（3）證明了該生物反應器對硝化細菌規模化快速富集培養并穩定產泥方法的可行性。為包埋固定化技術實現規模化應用在菌源制備方面提供了技術路線。通過硝化細菌培養實驗探究，優化了培養周期，解析了菌群演變規律。