酮洛芬注射液對靶動物奶牛的安全性研究

寇賀紅，付良凱，焦曉軍，周淑貞，李成應(yīng)

(佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，廣東佛山528234)

酮洛芬(ketoprofen)屬于芳基丙酸類非甾體類抗炎藥(non-steroids anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，在水中幾乎不溶，極易溶于甲醇，易溶于乙醇、丙醇或乙醚，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。它主要通過可逆性抑制環(huán)氧合酶(COXs)、促炎肽或脂氧化酶(LOXs) 的活性，從而抑制致炎性物質(zhì)前列腺素(PGs)、白三烯(LTs) 及血栓素(TXs) 的生物合成，使緩激肽釋放減少，進而發(fā)揮其良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用。研究發(fā)現(xiàn)，酮洛芬的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用強于阿司匹林、萘普生、消炎痛、布洛芬、雙氯芬酸和炎痛喜康等藥物，抗炎作用比阿司匹林強 150 倍，解熱作用比消炎痛強 4 倍，毒性僅為消炎痛的 1/20，且不良反應(yīng)與布洛芬相似且較輕[1]。酮洛芬于1967年首次合成，首個人藥制劑于1973年在法國上市。獸用制劑也在多個國家廣泛應(yīng)用，如西班牙輝瑞公司生產(chǎn)的 15%酮洛芬注射液(商品名：Danidol/Ederal)[2]，加拿大梅里亞公司生產(chǎn)的10%酮洛芬注射液(商品名：Anafen?)[3]，治療牛呼吸道感染、乳腺炎、乳腺水腫、躺臥母牛綜合征、內(nèi)毒血癥、關(guān)節(jié)炎和肌肉骨骼外傷等引發(fā)的發(fā)燒、疼痛和炎癥等相關(guān)疾病。目前國內(nèi)尚無酮洛芬注射液對靶動物奶牛安全性的相關(guān)研究。本試驗選用健康泌乳奶牛進行酮洛芬注射液的靶動物安全性試驗，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 試驗藥品 酮洛芬注射液，規(guī)格 100mL∶15g；批號:20160503，由佛山市南海東方澳龍制藥有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備 全自動動物血細胞分析儀：XFA6130型，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；全自動生化分析儀：BS300，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；牛奶體細胞計數(shù)儀：MINI5700型，北京康達智信科技有限公司。

1.3 試驗動物 20頭泌乳期健康荷斯坦奶牛(胎次:2～3胎)，體重為400～450 kg，由三門峽市合源奶牛養(yǎng)殖場提供。按奶牛場常規(guī)飼養(yǎng)，試驗期間奶牛不使用其他任何抗菌藥物、生殖激素等。

2 方 法

2.1 試驗分組及給藥 20頭健康試驗?zāi)膛ｋS機分為4組，每組5頭，設(shè)1倍推薦劑量(3 mg/kg·bw)、3倍推薦劑量(9 mg/kg·bw)、5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)3個受試藥物組(分別編號為1倍組、3倍組、5倍組)以及空白對照組(注射生理鹽水)。頸部肌肉注射，每日1次，連續(xù)給藥9 d。試驗持續(xù)至末次給藥后第15天，試驗期間按照牛場管理規(guī)程做好消毒防疫和防病工作，保證自由采食和飲水。

2.2 試驗評價指標 參照“VICH獸藥靶動物安全性研究指導(dǎo)原則概述”[4]和“靶動物安全試驗指導(dǎo)原則(征求意見稿)”[5]，從臨床表現(xiàn)和健康狀況、直腸溫度、血液學(xué)檢測、血清生化學(xué)檢測等方面進行觀察，判定結(jié)果。

2.2.1 臨床觀察 試驗期間觀察動物是否有與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如行為異常、精神抑郁、呼吸加深加快及糞尿排泄異常等變化情況。

2.2.2 血液學(xué)檢測 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時間尾靜脈采集血液3～5 mL，加入EDTA-2K，制備抗凝血用于血常規(guī)檢查，檢查參數(shù)主要有：紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、白細胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)等指標。

2.2.3 血清生化學(xué)檢測 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時間尾靜脈采集血液5～6 mL，制備非抗凝血，分離血清，進行血清生化指標測定，檢查參數(shù)有：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酐(CREA)、尿素(Urea)、間接膽紅素(DBIL)、總膽固醇(TC)等指標。

2.2.4 奶產(chǎn)量和乳汁體細胞數(shù) 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天統(tǒng)計奶牛奶產(chǎn)量，并采集奶樣20～30 mL進行乳汁體細胞數(shù)檢測。

2.2.5 直腸溫度 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天，用電子體溫計檢測奶牛直腸溫度。

2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 觀察記錄各劑量組和空白對照組試驗?zāi)膛Ｓ盟幥昂蟮呐R床癥狀，記錄各試驗組奶牛的血常規(guī)和血清生化指標數(shù)值，使用 SPSS20.0 統(tǒng)計軟件計算各指標的平均值與標準差，采用單因素方差分析，比較各組組內(nèi)給藥后不同時間點數(shù)據(jù)與給藥前第0天數(shù)據(jù)的差異性，如藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)，對其原因進行分析，并提出注意事項。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床癥狀變化 給藥期間各劑量組奶牛未表現(xiàn)異常反應(yīng)，如抵抗、興奮等。整個試驗期間，各劑量組奶牛精神狀態(tài)、直腸溫度、呼吸、采食、飲水和糞尿排泄均正常，與對照組相比，未觀察到有不同臨床表現(xiàn)。整個試驗過程奶牛全部存活，且未觀察到任何不良反應(yīng)。

3.2 血液學(xué)檢測 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時間靜脈采集抗凝血，進行血常規(guī)檢測，結(jié)果見表1-表4。數(shù)據(jù)顯示，各指標在給藥期間與給藥前相比差異不顯著(P>0.05)，均在文獻報道的范圍內(nèi)[6-13]，說明酮洛芬注射液以推薦劑量(3 mg/kg·bw)至5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)應(yīng)用于奶牛對其血液指標無明顯影響。

表1 空白對照組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測Tab 1 The hematology of the control group on day 0，1，7，15 after

表2 1倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測Tab 2 The hematology of the recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

表3 3倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測Tab 3 The hematology of three times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

表4 5倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測Tab 4 The hematology of five times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

3.3 血清生化指標檢查 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時間靜脈采集非抗凝血，分離血清，進行血液生化指標測定，結(jié)果見表5-表8。數(shù)據(jù)表明，1倍劑量組的TC濃度在末次給藥后第1天和第15天顯著低于給藥前水平(P≤0.05)；3倍劑量組的UREA濃度在末次給藥后第15天顯著低于給藥前水平(P≤0.05)；5倍劑量組的ALP濃度在末次給藥后第15天顯著低于給藥前水平(P≤0.05)；其余各指標在給藥期間與給藥前相比差異不顯著(P>0.05)。雖然上述試驗組的某些指標在給藥后與給藥前第0天數(shù)據(jù)相比存在差異性改變，但所有檢測值均在文獻報道的正常范圍內(nèi)[6-13]。試驗結(jié)果說明酮洛芬注射液以推薦劑量(3 mg/kg·bw)至5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)應(yīng)用于奶牛對其血清生化指標無明顯影響。

表5 空白對照組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標Tab 5 The blood chemistry of the control group on day 0,1,7,15 after

表6 1倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標Tab 6 The blood chemistry of the recommended group on day 0,1,7,15 after

表7 3倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標Tab 7 The blood chemistry of three times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

表8 5倍照組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標Tab 8 The blood chemistry of five times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

3.4 奶產(chǎn)量和乳汁體細胞數(shù)統(tǒng)計 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天統(tǒng)計奶牛奶產(chǎn)量，并采集奶樣20～30 mL進行乳汁體細胞數(shù)檢測，結(jié)果見表9和表10，各組受試奶牛在給藥前后日產(chǎn)奶量無明顯差異(P>0.05)，給藥前后受試奶牛的乳汁體細胞數(shù)均小于20萬，各組受試奶牛在給藥前后乳汁體細胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)，顯示酮洛芬注射液對泌乳期奶牛的產(chǎn)奶性能無影響。

表9 給藥前后奶牛日產(chǎn)量統(tǒng)計表Tab 9 Milk production of dairy cattles before and after dosing kg/d

表10 給藥前后奶牛乳汁體細胞數(shù)統(tǒng)計表Tab 10 SCC of dairy cattles before and after dosing 10000/mL

3.5 直腸溫度 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天，用電子體溫計檢測奶牛直腸溫度。奶牛正常體溫在37.5 ℃～39.5 ℃之間[11-13]。本試驗中受試奶牛的直腸溫度檢查結(jié)果見表11，各試驗組直腸溫度無明顯差異(P>0.05)，均在正常值范圍內(nèi)，表明酮洛芬注射液對泌乳期奶牛的體溫?zé)o明顯影響。

表11 給藥前后奶牛直腸溫度統(tǒng)計表Tab 11 The rectal temperature of dairy cattles before and after treatment ℃

4 小 結(jié)

靶動物安全性試驗是新獸藥臨床試驗研究的重要內(nèi)容，主要用于研究受試藥物在治療范圍或治療范圍以上劑量時對生理功能潛在的不良影響[14]。本研究結(jié)果表明，酮洛芬注射液以推薦劑量(3 mg/kg·bw)至5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)

應(yīng)用于奶牛是安全的。鑒于目前國內(nèi)尚無酮洛芬注射液在奶牛上使用的安全性研究，因此本試驗為酮洛芬注射液在奶牛臨床中的使用提供了科學(xué)依據(jù)。