黑皮雞樅菌液體培養(yǎng)基配方篩選

劉運偉，郭興

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)院伊春分院，黑龍江 伊春 153000)

黑皮雞樅菌(Oudemansiellaradicata)，又名長根金錢菌、露水雞樅、長根小奧德蘑等[1]，屬中偏高溫型菇類，為擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、小奧德蘑屬(Oudemansiella)的腐生菌[2]。近幾年，黑皮雞樅逐漸被人們所熟知，通過人工大面積種植，使栽培生產(chǎn)者看到了黑皮雞樅的生產(chǎn)方式簡便，市場前景較好的優(yōu)點。為了使黑皮雞樅產(chǎn)業(yè)邁入標準化、規(guī)模化、工廠化水平，研究液體菌種生產(chǎn)勢在必行。液體菌種是一種高效的菌種[3]，可以達到快速生長，提高生產(chǎn)效率。本文對黑皮雞樅進行液體培養(yǎng)基配方的篩選，為實際生產(chǎn)提供理論的指導(dǎo)。

1 材料

1.1 供試菌株

試驗所用菌種來源于江蘇高郵市科學(xué)食用菌研究所。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂 20.0 g，純水定容至 1000 mL。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖 3.0 g/100 mL、蛋白胨 0.3 g/100 mL、硫酸鎂 0.05 g/mL、磷酸二氫鉀 0.1 g/100 mL。

1.3 試劑

試驗所使用的主要化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純或食品級：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、FeSO4、ZnSO4、NaCl、濃HCl、NaOH、VC、VB1、VB2、VB6。玉米粉、黃豆粉、小米粉為玉米、黃豆、小米經(jīng)烘干粉碎過100目。

1.4 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備有超凈工作臺(東莞雅寧凈化科技有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司)，BSD-YF3200智能精密型搖床(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，YXQ-30SII高壓滅菌器(濟南杰島分析儀器有限公司)，AUW120D電子天平(日本島津)。

2 方法

2.1 菌種活化與接種

制作斜面培養(yǎng)基，在無菌條件下，取黑皮雞樅菌種置于空斜面培養(yǎng)基的中間部位，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7天。

在無菌條件下，取黑皮雞樅菌種的10個菌塊接入到盛有150 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床上以25 ℃、150 r/min的條件培養(yǎng)7天。

2.2 實驗測定方法

菌絲體生物量的測定：取培養(yǎng)7天后的黑皮雞樅液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基和菌絲體一起倒入濾網(wǎng)上，并用純水反復(fù)沖洗，再將菌絲體置于培養(yǎng)皿中，放入70 ℃烘箱中至恒重后，稱重[4]。

2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 碳源試驗。在配置液體培養(yǎng)基時，使碳源分別為3.0 g/100 mL的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、小米粉進行碳源單因素試驗。

2.3.2 氮源試驗。在配置液體培養(yǎng)基時，使氮源分別為0.3 g/100 mL的蛋白胨、黃豆粉、酵母膏、尿素、硫酸銨進行氮源單因素試驗。

2.3.3 無機鹽及不同添加量試驗。在配置液體培養(yǎng)基時，使KH2PO4的添加量分別為0.05 g/100 mL、0.1 g/100 mL、0.15 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.25 g/100 mL。

在配置液體培養(yǎng)基時，使MgSO4的添加量分別為0.01 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.05 g/100 mL、0.07 g/100 mL、0.09 g/100 mL。

另在液體培養(yǎng)基中額外添加FeSO4、CaCO3、NaCl、ZnSO4，并與空白液體培養(yǎng)基進行比較。

2.3.4 維生素試驗。在液體培養(yǎng)基中分別添加0.001 % 的VC、VB1、VB2、VB6。

2.3.5 正交優(yōu)化。在單因素試驗結(jié)果上，以碳源、氮源、無機鹽、維生素為影響因子，建立 L9(34)正交表。

表1 正交試驗表

3 結(jié)果

3.1 碳源試驗結(jié)果

由圖1中可以看出，黑皮雞樅菌絲體以玉米粉為碳源的吸收利用效果顯著高于其他碳源，菌絲體生物量達到1.592 g/100 mL；可能是玉米粉中含玉米素等多種營養(yǎng)成分，能促進菌絲體生長。因此，玉米粉為最佳碳源。

圖1 碳源篩選試驗

3.2 氮源試驗結(jié)果

由圖2中可以看出，黑皮雞樅菌絲體以蛋白胨為氮源的吸收利用效果好于其他4種氮源，菌絲體生物量為0.848 g/100 mL；另外黑皮雞樅菌絲體對尿素、硫酸銨的利用效果也較好，而對尿素和硫酸銨幾乎不能利用。因此，蛋白胨為最佳氮源。

圖2 氮源篩選試驗

3.3 無機鹽及其添加量試驗結(jié)果

由圖3、圖4中可以看出，黑皮雞樅菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加出現(xiàn)先增加后降低現(xiàn)象，在KH2PO4添加量為0.1 g/100 mL時，菌絲體生物量獲得最多為0.621 g/100 mL。因此，KH2PO4的最佳添加量為0.1 g/100 mL。

圖3 KH2PO4對菌絲生物量的影響

圖4 MgSO4對菌絲生物量的影響

由圖4可以看出，黑皮雞樅的菌絲體生物量隨MgSO4添加量的逐漸增加出現(xiàn)先增加后降低現(xiàn)象，在MgSO4添加量為0.03 g/100 mL時，菌絲體生物量達到最大多為0.710 g/100 mL。因此，MgSO4的最佳添加量為0.03 g/100 mL。

由圖5可以看出，在各無機鹽濃度均為0.3 g/100 mL時，只有添加了NaCl的黑皮雞樅菌絲體生物量為0.645 g/100 mL高于空白對照，而添加了FeSO4、CaCO3、ZnSO4的菌絲體生物量低于空白對照。因此，NaCl為最佳無機鹽。

圖5 無機鹽篩選試驗

3.4 不同維生素對發(fā)酵的影響

由圖6中可以看出，在各維生素濃度均為0.001%時，只有添加了VB1的黑皮雞樅菌絲體生物量為0.806 g/100 mL高于空白對照，而添加了VC、VB2、VB6的黑皮雞樅菌絲體生物量低于空白對照。因此，VB1為最佳維生素。

圖6 維生素篩選試驗

3.5 優(yōu)化正交試驗

選取碳源為玉米粉，氮源為蛋白胨，無機鹽為NaCl，維生素為VB1作為影響因子，建立L9(34)正交表，KH2PO4和MgSO4添加量分別0.1 g/100 mL和0.03 g/100 mL。

由表3可以看出，對菌絲體生物量影響最大的是氮源，其次是碳源，再次是無機鹽，最后是維生素，最佳組合是A2B3C1D2，即玉米粉3 g/100 mL、蛋白胨0.4 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、MgSO40.03 g/100 mL、NaCl 0.01 g/100 mL、VB10.002%。

表3 正交試驗結(jié)果

4 結(jié)論

隨著科技的進步，工廠化生產(chǎn)將成為食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向，而體液菌種生產(chǎn)正是工廠化所必需的，本文對黑皮雞樅液體培養(yǎng)基進行研究、篩選，意在為黑皮雞樅的工廠化、規(guī)模化、標準化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。本文得出，黑皮雞樅液體最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉3 g/100 mL、蛋白胨0.4 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、MgSO40.03 g/100 mL、NaCl 0.01 g/100 mL、VB10.002%。