馬鈴薯組培苗內生菌治理方法研究

張秋萍 黃醒師 貢 劍 鄒玉興 居玉玲

（1江陰市農業技術推廣中心，江蘇省無錫市 214405；2江陰沃土農業生物科技開發有限公司，江蘇省無錫市 214415；3江陰市種子管理站，江蘇省無錫市 214400）

目前，我國馬鈴薯種植面積達5×106hm2以上，對脫毒種薯的需求非常大，脫毒微型種薯（即原原種）也因此成為保證馬鈴薯高產的基礎。雖然國內規模化生產馬鈴薯組培苗繼而生產馬鈴薯原原種的企業相當普遍，但在馬鈴薯組培苗規模化生產中，組培苗易受內生菌感染的問題一直困擾著眾多的生產者和研究者，若對內生菌處置不當，不僅會影響馬鈴薯組培苗的質量和數量，還會直接影響馬鈴薯組培苗的生產計劃安排，進而造成生產單位人、財、物的極大浪費。據文獻報道，馬鈴薯組培苗內生菌的殺菌方法基本上是在培養基中添加殺菌劑，但絕大部分殺菌劑處理的時效有限，且對后續組培苗的繼代繁殖也有一定影響。鑒于此，筆者擬進行馬鈴薯組培苗內生菌治理方法試驗研究，以期找到有效根除馬鈴薯組培苗內生菌的方法。

1 材料與方法

1.1 菌源判斷

馬鈴薯組培苗內生菌分離培養后，經南京理工大學環境與生物工程學院進行鑒別，其分類地位可能為革蘭氏陰性菌寡養單胞菌屬Stenotro phomonassp.（包括有8個種，侵染馬鈴薯組培苗的內生菌是其中的一種）。其廣泛存在于土壤、塵土、淡水、湖泥、植物根系、農副產品、人和動物的體表及消化道中，最適生長溫度為35 ℃，在4 ℃條件下不生長，近半數菌株在42 ℃時生長，為專性需氧菌，對營養的要求不高，在普通瓊脂平板上即可生長良好。

1.2 品種、試劑與器具

供試馬鈴薯品種為“費烏瑞它”（Favorita）。試驗試劑為0.1%升汞（HgCl2）和10%次氯酸鈉（NaClO）。培養器皿為瓶底直徑6 cm、瓶高9 cm、沒有瓶肩的直口瓶，容積為250 mL，每個培養瓶接種16株苗，瓶蓋采用封口膜和硫酸紙棉繩綁扎封口；其他器具包括若干個小燒杯（每個處理配備1個燒杯，用于升汞處理）、存放廢棄水的大燒杯、剪子、鑷子、剝離專用針、手術刀、無菌水（用三角瓶裝純凈水，不能太滿，占容器的1/3，滅菌后備用，pH不超過7，EC值在20以下）、濾紙（裝入培養皿內）、培養皿、器械手術刀和專用工具。燒杯均用牛皮紙或報紙包好，放入高壓滅菌鍋內滅菌，所有器具均提前滅菌，在操作前送往超凈工作臺。

1.3 供試材料選擇試驗

將感染內生菌的馬鈴薯組培苗植株，分上、中、下部三段莖段剪下，其中，最上面的部位是2葉1心帶生長點的莖段；中間部位是剪去生長點后，下面帶1片葉的中間莖段；下面部位是靠近根部上方帶1片葉的莖段。上述莖段分別扦插在MS培養基上（培養基在高壓121 ℃條件下滅菌18～19 min，緩沖間冷卻后，送至無菌室），每個部位轉接30瓶，生長8 d后，觀察內生菌的分布情況。

1.4 內生菌處理試驗

在1.3觀察的基礎上，選取感染內生菌最輕的莖段（2葉1心帶生長點）作供試材料，分別用0.1%升汞和10%次氯酸鈉浸泡處理，共設4個不同時間段：（1）100 s、（2）110 s、（3）120 s、（4）140 s，另設一個不做任何處理的對照（CK）。每處理均接種30瓶。

試劑處理時，將剪下的莖段浸泡在試劑內，并不斷晃動，使試劑作用到莖段的每個部位，再用無菌水清洗4～5次，將莖段放在經高壓滅菌過的濾紙上吸干水（濾紙在使用前，用鑷子夾住，在酒精燈上轉圈烤一下，以充分吸走外植體上的水分，降低污染率），然后插在滅菌過的培養基上，送至培養室培養，8 d后觀察殺菌效果及各處理對組培苗生長的影響（鑒于殺滅內生菌的化學試劑對組培苗正常細胞也有損傷，故需觀察統計組培苗葉片上的枯斑點）。

2 結果與分析

2.1 供試材料選擇

由表1可知，馬鈴薯組培苗植株三個部位均感染內生菌，故內生菌隨著植物細胞共同生長。組培苗不同部位的莖段均會感染內生菌，僅是菌落大小有所差異，其中以含2葉1心生長點的莖段感染內生菌的程度最輕。

表1 組培苗不同部位的莖段上內生菌分布情況

2.2 內生菌處理

由表2可知，對照無干凈瓶苗，處理（1）的干凈瓶苗率為87%，其余3個處理的干凈瓶菌率均為100%，但處理（3）、（4）的組培苗葉片有損傷，故以處理（2）為最佳處理時間。由表3可知，4個處理和對照均無干凈瓶苗，且4個處理的組培苗葉片均有不同程度的損傷，表明10%次氯酸鈉的殺菌效果遠遜于0.1%升汞。在實際的馬鈴薯規模化生產中，為殺滅內生菌，宜采用0.1%升汞處理馬鈴薯組培苗110 s。

表2 0.1%升汞的殺菌效果和對組培苗生長的影響

3 結論與討論

3.1 結 論

試驗結果表明，含2葉1心生長點的莖段，是整個馬鈴薯植株感染內生菌程度最輕的部位，也是治理馬鈴薯組培苗內生菌最合適的切入點；同時，既能殺死內生菌、又對馬鈴薯組培苗沒有損害的最佳藥劑為0.1%升汞，最佳處理時間為110 s；10%次氯酸鈉的殺菌效果不夠理想，且對植株有傷害。

表3 10%次氯酸鈉的殺菌效果和對組培苗生長的影響

3.2 討 論

通過對2004年以來有關文獻的搜索，以及筆者自身多年的試驗摸索，一直沒有發現徹底根除馬鈴薯組培苗內生菌的有效方法，且一般在莖尖剝離中，通常用0.1%升汞對外植體進行滅菌，而直接用于組培苗莖段滅菌的尚未見有文獻報導。本試驗用0.1%升汞處理組培苗上部莖段110 s，能起到根除馬鈴薯組培苗內生菌的效果，同時，根據筆者的實踐，即使經過多代的繼代繁殖，只要沒有環境因素和操作因素的影響，就不會有內生菌再感染。因此，用0.1%升汞（HgCl2）浸泡馬鈴薯組培苗110 s，是目前根除馬鈴薯組培苗內生菌的有效方法，本方法可應用于馬鈴薯組培苗的規模化生產。

通常內生菌的早期感染是從根部開始發現，不仔細觀察不易發現，且植株莖葉生長很正常，但若繼續進行組培苗擴繁，內生菌的感染會越來越明顯，造成整個根部出現黃色菌膿，繼續擴繁最終會發生不長根爛苗，造成毀滅性損失。因此，需在感染早期加以識別和剔除。可通過一看二聞三觀察識別是否感染內生菌，即：一看是看瓶底組培苗根部是否有內生細菌污染；二聞是打開瓶蓋聞，有內生菌感染的瓶苗會聞到細菌侵染的酸味；三觀察是仔細觀察植株根部是否有牛奶狀的乳白色液體小點，若發現需及時挑出。

此外，防治馬鈴薯組培苗感染內生菌，還需切實采取以下綜合措施：（1）在留基礎苗時，選擇根系干凈的健康苗；（2）在培養生長時，注意光照強度和長度，晝夜要有溫差，光照需充足，強光照可有效抑制內生菌的發生；（3）無菌室和超凈工作臺需保持潔凈，接種器械包括電子滅菌器內的石英珠，每天要洗干凈并進行高壓滅菌；（4）操作人員衣帽干凈，戴上口罩，在無菌室不能大聲喧嘩（以防口腔菌感染培養基），嚴格按照分苗操作規程進行滅菌、操作；（5）采用反復莖尖培養或分生組織培養的方法來脫除內生菌。