“海蜜”系列甜瓜蔓枯病抗性來源分子標記初步評價

孫亞亭 陳 靜 孫博文 包衛紅 錢春桃*

(1南京農業大學園藝學院作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇省南京市 210095；2海門市農業科學研究所，江蘇省南通市 226100 ）

“海蜜”系列甜瓜因抗逆性強、口感好，在江蘇省及其周邊地區得到了廣泛栽植；但在其生產過程中發現，“海蜜”系列甜瓜有感染蔓枯病的現象，尤其在設施連作條件下，蔓枯病發生風險較大。蔓枯病是一種在葫蘆科瓜類植物上常見的病害，甜瓜生產上患病植株可高達 25%以上，嚴重時可造成瓜類減產80%[1-2]。目前，化學防治是甜瓜生產上防治蔓枯病常用的方法，但易造成環境污染。因此，篩選抗病資源、培育抗病品種是防御甜瓜蔓枯病發生既生態又經濟的措施。但是，甜瓜蔓枯病病原菌存在致病性分化，甜瓜品種僅攜帶單個抗病基因，在生產過程中抗性會減弱甚至完全喪失[3-5]，而不同抗性基因的聚合有助于提高作物的抗性和抗譜[6-8]，且國際上先后報道了多種甜瓜蔓枯病抗源，包括PI140471、PI1 57082、PI511890、PI482398、PI482399和PI420145等，抗性基因分別為Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、gsb-5和Gsb-6[9-10]，這為“海蜜”系列甜瓜利用不同抗性基因聚合改良對蔓枯病的抗性提供了可能。

開展抗性聚合改良，首先需進行人工接種鑒定和遺傳群體構建，以考察抗性分離情況，確定抗性基因是非等位基因，這是一個周期較長的過程。而分子標記輔助選擇可以提高育種效率。前人研究顯示，大多數甜瓜品種的抗性來源于PI140471（Gsb-1）[8]，實驗室前期研究也發現，抗源PI482398（Gsb-4）的抗性高于Gsb-1[11]。因此，筆者擬采用Gsb-1和Gsb-4已有的分子標記對“海蜜”系列甜瓜的蔓枯病抗性來源進行分子標記快速鑒定，從而為“海蜜”系列甜瓜利用不同蔓枯病抗性基因進行聚合改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 甜瓜材料和接種菌株

6份“海蜜”系列甜瓜材料（“海蜜2號”“海蜜4號”“海蜜5號”“海蜜6號”“海蜜8號”“海蜜10號”）由江蘇省南通市海門市農業科學研究所提供，甜瓜單基因抗源材料PI140471（Gsb-1）（CK1）、PI 482398（Gsb-4）（CK2）由美國康乃爾大學Molly John 教授提供，感病品種“白皮脆”（CK3）由新疆農業科學院提供。

蔓枯病病菌為本實驗室分離純化并保存的A1型菌株，菌株的分生孢子在PDA培養基上經25 ℃暗培養7 d后，再進行4 d間歇紫外燈（每天12 h紫外/12 h黑暗）處理產生[12]，在顯微鏡下利用血球計數板將分生孢子懸浮液配成5×105個/mL備用。

1.2 田間接種鑒定

試驗于2019年秋季在南京農業大學白馬基地進行。所有甜瓜材料采用50孔穴盤播種育苗，每個品種種植30株，重復3次。7月25日播種，8月10日待幼苗長至3葉1心后定植于塑料拱棚，采用地膜覆蓋栽培，田間管理正常。11月2日采用噴霧法[3]接種病菌，用噴霧器向功能葉反復噴灑制備好的菌液，直至葉面滴水，2周后觀察植株發病情況。

甜瓜蔓枯病病情分級標準：0級，無病斑；1級，老葉上邊緣壞死或斑點＜10 mm，新葉無病斑；2級，新葉上邊緣壞死或斑點＜10 mm，老葉邊緣壞死；3級，多數葉片有感染，葉壞死面積＜25%；4級，25%＜葉壞死面積≤50%；5級，葉壞死面積＞50%。

平均病級計算公式： RI=∑(級值×株數) ÷總株數。

根據平均病級（RI）確定蔓枯病抗性級別：高抗(HR)，RI＜1.0；抗(R)，1.0≤RI＜2.0；中抗(MR)，2.0≤RI＜3.0；感(S)，3.0≤RI＜4.0；高感(HS)，RI≥4.0。

1.3 DNA提取及分子標記檢測

DNA提取參照 CTAB 法。用于檢測抗病基因Gsb-1和Gsb-4的分子標記為本課題組設計[11，13]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見表1。

PCR總反應體積為20μL： ddH2O 12.1μL，10×PCR Buffer 2.0μL，2 mmol/L dNTP 1.5 μL，25 mmol/L MgCl21.2μL，10μmol/L引物各1.0μL，5U/μLTaq聚合酶 0.2μL，30 ng/μL模板DNA 1.0μL。

擴增反應條件：94 ℃反應5 min；94 ℃反應30 s，55 ℃反應30 s，72 ℃反應80 s，35個循環；72 ℃反應5 min；保持4 ℃。

表1 抗病基因與對應分子標記

PCR產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.4 數據分析

利用 Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 對蔓枯病的田間抗性表現

自然發病鑒定有時發病較輕，不能代表品種或材料的真實抗病程度。由表2可知，兩種抗源材料PI140471和PI482398對蔓枯病均表現為高抗；感病對照“白皮脆”發病較重，表現為感病；“海蜜6號”對蔓枯病表現為抗病，其余品種對蔓枯病均表現為中抗。

表2 蔓枯病田間抗性評價

2.2 抗蔓枯病基因分子標記的鑒定

通過對“海蜜”系列甜瓜進行抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-4分子標記的PCR檢測，發現6份“海蜜”系列甜瓜均未得到與Gsb-1分子標記相同的190 bp條帶；“海蜜2號”“海蜜6號”擴增出了與Gsb-4分子標記相同的120 bp條帶和180 bp條帶，而“海蜜4號”“海蜜5號”只擴增出Gsb-4標記的180 bp條帶，“海蜜8號”“海蜜10號”只擴增出120 bp條帶。見表3。

表3 抗蔓枯病基因分子標記檢測

3 結論及討論

田間抗性鑒定結果表明，“海蜜6號”對蔓枯病的抗性表現達到抗病等級，“海蜜2號”“海蜜4號”“海蜜5號”“海蜜8號”“海蜜10號”均只達到中抗等級。其中，“海蜜2號”對蔓枯病的抗性水平與以前報道的結果一致[14]，表明本研究采取的田間接種鑒定是可靠的。至于“海蜜6號”比其它“海蜜”系列甜瓜對蔓枯病抗性強的原因，則需對它們的抗性基因結構和表達調控的異同進行比較研究。

結合抗病基因分子標記P C R檢測結果，發現“海蜜2號”“海蜜6號”可以擴增出Gsb-4分子標記的兩條帶，但不能擴增出Gsb-1的目標片段。因此，本研究初步判斷“海蜜2號”“海蜜6號”的染色體中具有與Gsb-4相同的抗性位點，但不具有與Gsb-1相同的抗性位點。結合前期研究結果，聚合抗源對不同濃度的蔓枯病病菌均表現為抗，而單一抗源對不同濃度蔓枯病病菌表現出選擇性抗性且抗性水平低于聚合抗源。因此，對于“海蜜2號”“海蜜6號”（含有Gsb-4），可用PI140471(Gsb-1)來提高其抗性；其余“海蜜”系列甜瓜只擴增出一條Gsb-4的片段，還不能判斷其抗性來源與Gsb-4是否相同，需進一步鑒定，但它們均未擴增出Gsb-1的目標產物，也可采用PI140471（Gsb-1）進行抗性改良。