沉默ATAD3A對黑素瘤A375細胞增殖、侵襲和遷移的影響及機制研究

羅茂 羅卓夫 畢建軍 許飏

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，四川瀘州646000；2重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院皮膚科401120

羅茂現(xiàn)在重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院皮膚科

惡性腫瘤的發(fā)生演進與細胞生長、凋亡、自噬、物質(zhì)及能量代謝等異常密切相關(guān)，線粒體在調(diào)節(jié)這些生物過程中發(fā)揮重要作用，其功能異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性已成為抗癌研究的熱點之一［1］。三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATPase family AAAdomain containing protein 3A，ATAD3A）是一種定位于線粒體內(nèi)膜的ATP 酶，具有ATP 酶的活性，對維持線粒體結(jié)構(gòu)、功能以及線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用至關(guān)重要［2-3］，在細胞能量代謝、物質(zhì)合成、自噬、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用［4-5］，其功能異常與腫瘤等疾病的發(fā)生演進密切相關(guān)［6］。近年研究顯示，ATAD3A 在肺癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤組織中過表達，并與腫瘤分期、組織學分級、生存預后等臨床病理特征密切相關(guān)，可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并誘導化療抵抗，其機制涉及在乏氧狀態(tài)下為腫瘤細胞增加能量供應，抑制自噬、凋亡，促進細胞周期進展以及調(diào)節(jié)一些腫瘤促進蛋白的表達而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展等［7-10］。黑素瘤的發(fā)病機制未明，涉及上述多種機制的異常［11］，而ATAD3A在黑素瘤惡性進展中的作用尚未見報道。本實驗旨在初步探討ATAD3A 在黑素瘤組織中的表達情況以及沉默ATAD3A 對黑素瘤A375細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，為研究ATAD3A 在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)和參考。

材料與方法

一、組織、細胞與主要試劑

2019 年8-12 月在重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院皮膚科收集3 例黑素瘤患者的黑素瘤組織及其癌旁組織。3例患者中，1例為45歲男性，左上臂發(fā)生黑素瘤，1 例為63 歲女性，會陰部發(fā)生黑素瘤，1 例為女52 歲性，右足拇趾發(fā)生黑素瘤。本研究取得重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會同意（批件號：2019061）。黑素瘤A375細胞產(chǎn)自中國科學院上海細胞庫。沉默ATAD3A 慢病毒和空載對照慢病毒由蘇州吉瑪基因股份有限公司包裝。The fast200 KIT產(chǎn)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司，Prime Script?RT Master Mix 及SYBR?Premix ExTaq?產(chǎn)自大連TaKaRa公司。兔抗人ATAD3A單克隆抗體產(chǎn)自英國Abcam 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、SRY 基因相關(guān)的高遷移率族蛋白盒2（SOX2）、NANOG、八聚體結(jié)合蛋白4（OCT4）、波形蛋白、SLUG、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）單克隆抗體均產(chǎn)自美國CST 公司。CCK-8 試劑產(chǎn)自日本同仁化學研究所。BCA 蛋白測定試劑盒產(chǎn)自北京碧云天生物技術(shù)公司。Transwell 小室和基質(zhì)膠產(chǎn)自美國賽默飛公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：將生長狀態(tài)良好的A375 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞密度達80%～90%融合時換液及傳代。

2.慢病毒的感染和篩選：將A375 細胞懸液接種到6 孔板培養(yǎng)，每孔1 ml 含1×105個細胞，當細胞達60%融合時，向3 個孔內(nèi)加入2 μl 滴度為1 ×108TU/ml的沉默ATAD3A慢病毒液，另外3孔內(nèi)加入2 μl 滴度為1 × 108TU/ml 的空載對照慢病毒液。培養(yǎng)48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察熒光強度，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染細胞株。將穩(wěn)定感染沉默ATAD3A 慢病毒和陰性對照慢病毒的細胞分別記為shATAD3A組和shCtrl組。

3.實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）驗證慢病毒感染效率：當shATAD3A、shCtrl 兩組細胞融合度70%～80%時，使用the fast200 試劑盒提取總RNA，使用Prime Script?RT Master Mix試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，體系如下：5 × Prime Script?RT Master Mix 8 μl，總RNA 2 μg，DEPC水30 μl，總體積40 μl，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，85 ℃滅活5 s，4 ℃保存。PCR 擴增反應體系：SYBR?Premix ExTaq?5.0 μl，正向引物和反向引物各0.4 μl，cDNA 1.0 μl，DEPC 水3.2 μl，總體積10 μl，離心混勻后，按以下條件行PCR擴增：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，85 ℃延伸5 s，以上變形、退火、延伸3 個步驟循環(huán)45 次，70 ℃～95 ℃，每秒升溫0.4 ℃以分析熔解曲線。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)反應的Ct值，以2-△△Ct法計算mRNA表達量。引物序列：ATAD3A正向引物為5′-GCGA GCCACCGAGAAGATAAG-3′，反向引物5′-TGGAC CATCTCATTGATGCGG-3′；GAPDH正向引物5′-GG AGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物5′-GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG-3′。實驗重復3次。

4.Western 印跡檢測黑素瘤組織及shATAD3A組和shCtrl 組細胞中相關(guān)蛋白的表達情況：將黑素瘤組織和癌旁組織以研缽研磨成組織勻漿后，采用蛋白裂解液提取蛋白；常規(guī)消化對數(shù)生長期shATAD3A組和shCtrl 組A375細胞，收集裂解提取蛋白液。采用BCA法測定蛋白濃度，將含20 μg蛋白的蛋白液加入10%聚丙烯酰胺凝膠孔內(nèi)進行恒流10 mA 電泳。使用甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜。室溫搖床封閉2 h。加入按1∶100比例稀釋的 兔 抗 人ATAD3A、GAPDH、SOX2、NANOG、OCT4、波形蛋白、SLUG、MMP2 單克隆抗體4 ℃孵育過夜；加入稀釋度為1∶1 000 的山羊抗兔抗體室溫孵育1 h。采用ECL 發(fā)光液顯色，放入凝膠成像儀中成像分析，內(nèi)參為兔抗人GAPDH。同時采用美國National Institutes of Health（NIH）的Image J軟件分析Western 印跡的條帶灰度值，目的蛋白的相對表達量=目標蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。實驗重復3次。

5. 克隆形成實驗檢測A375 細胞克隆形成能力：將生長狀態(tài)良好的shATAD3A、shCtrl 兩組細胞消化稀釋成細胞懸浮液，接種到6孔板，每孔200個細胞，培養(yǎng)1周后，用10%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后拍照，計數(shù)直徑＞1 mm 的克隆數(shù)及克隆形成數(shù)目。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

6.細胞計數(shù)實驗（CCK-8）檢測A375 細胞增殖能力：將shATAD3A、shCtrl 兩組細胞計數(shù)后，按照每孔1 000個細胞、100 μl培養(yǎng)基接種于96孔板，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育。每隔12 h 向shATAD3A、shCtrl 組A375 細 胞 孔 中 加 入10 μl CCK-8 試劑。孵育2 h 后在酶標儀上檢測波長490 nm處的吸光度，連續(xù)測定4 d后行統(tǒng)計分析，以只加CCK-8 試劑的孔吸光度值作為空白孔吸光度值，細胞真實吸光度值（表示細胞增殖活性）=實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值，吸光度值越大，細胞增殖活性越強。實驗重復3次。

7.Transwell侵襲實驗檢測A375細胞的侵襲能力：將基質(zhì)膠和培養(yǎng)基按1∶6 比例稀釋混合，然后取15 ml 混合液涂抹在Transwell 小室的上室，放入24孔板后置于培養(yǎng)箱15 min 后吸掉上室析出的液體，加 入200 μl 無 血 清 培 養(yǎng) 基 水 化。 對shATAD3A、shCtrl 兩組細胞計數(shù)后，使用無血清培養(yǎng)基將其重懸，將200 μl含1×104個細胞的懸液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清培養(yǎng)基500 μl，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采用多聚甲醛固定，棉簽擦拭掉上室細胞，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下（100倍）拍照并計數(shù)下室細胞的數(shù)目。實驗重復3次。

8. 劃痕實驗檢測A375 細胞的遷移能力：將shATAD3A、shCtrl 兩組細胞消化計數(shù)，按2×105個細胞/孔加入24孔板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞生長達90%～100%融合度時，使用10 μl槍頭水平垂直劃線，用磷酸鹽緩沖液反復洗滌以去掉脫落細胞，然后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并在0、6、12、18 和24 h 時測定劃痕寬度（0 h 時為“D”，余為“d”），計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（D-d）/D×100%。實驗重復3次。

9.統(tǒng)計學分析：采用SPSS18.0 軟件進行統(tǒng)計，Graphpad 6.0 軟件作圖，結(jié)果以±s 顯示。兩組間實驗指標的差異分析采用獨立樣本t檢驗，P ＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、ATAD3A在黑素瘤組織中的表達

ATAT3A 在黑素瘤組織的表達（0.731±0.115）高于癌旁組織（0.303 ± 0.027），t = 10.825，P ＜0.001，見圖1。

圖1 Western印跡檢測黑素瘤組織（T1、T2、T3）及其癌旁組織（N1、N2、N3）中ATAD3A 的表達 ATAD3A：三磷酸腺苷酶家族蛋白3A；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖2 慢病毒感染A375細胞構(gòu)建沉默ATAD3A黑素瘤穩(wěn)定細胞系 2A：慢病毒感染A375 細胞后，熒光顯微鏡下shATAD3A 組和shCtrl組細胞均顯示綠色熒光（比例尺=30 μm）；2B：Western印跡檢測兩組細胞中ATAD3A的表達。ATAD3A：三磷酸腺苷酶家族蛋白3A；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

二、構(gòu)建沉默ATAD3A黑素瘤穩(wěn)定細胞系

慢病毒感染A375 細胞后，熒光顯微鏡下shATAD3A、shCtrl 兩組細胞均顯示綠色熒光。shATAD3A 組ATAD3A mRNA 表 達 水 平 為0.230 ±0.073，shCtrl 組為（1.000 ± 0.244），兩組比較，t =9.461，P ＜0.001；蛋白表達水平分別為0.866±0.115和0.279±0.267，t=8.595，P=0.002。表明已成功構(gòu)建敲低ATAD3A的黑素瘤穩(wěn)定細胞系，見圖2。

三、沉默ATAD3A 對A375 細胞克隆形成和增殖能力的影響

shATAD3A 組A375 克隆形成率（22.667% ±2.510%）明顯低于shCtrl 組（43.667% ± 5.030%），t=6.464，P=0.003，且形成的克隆體積變小，見圖3。CCK-8實驗顯示，與shCtrl組相比，shATAD3A組黑素瘤細胞增殖活性從第2天開始一直到第4天均明顯減弱（第2、2.5、3、3.5、4天t值分別為5.040、4.565、4.785、5.847、10.146，P值＜0.05或＜0.001），見圖4。

四、沉默ATAD3A 對A375 細胞侵襲和遷移能力的影響

圖3 克隆形成實驗檢測沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）對A375 細胞克隆形成能力的影響 與shCtrl 組相比，shATAD3A 組A375 細胞形成的克隆體積變小，克隆數(shù)減少（比例尺=200 μm）

圖4 CCK-8 實驗檢測沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）對A375 細胞增殖能力的影響 與shCtrl 組相比，shATAD3A組細胞的增殖活性自第2天開始明顯減弱。a：P ＜0.05；b：P ＜0.01；c：P ＜0.001

Transwell 侵襲實驗顯示，shATAD3A 組A375細胞通過下室細胞數(shù)目（68.330±13.050）明顯少于shCtrl 組（234.330± 19.139，t = 12.411，P ＜0.001），見圖5 。劃痕實驗顯示，與shCtrl 組相比，shATAD3A組細胞從12 h開始遷移速度減慢，劃痕愈合率降低（12、18、24 h時t值分別為5.835、6.015、6.574，均P ＜0.01），見圖6。

圖5 Transwell侵襲實驗檢測沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）對A375 細胞侵襲能力的影響 與shCtrl 組相比，shATAD3A 組A375 細胞通過小室下室的細胞明顯減少（比例尺=100 μm）

五、沉默ATAD3A 對A375 細胞自我更新相關(guān)蛋白和侵襲遷移相關(guān)蛋白的影響

Western 印跡檢測顯示，與shCtrl 組相比，shATAD3A 組A375 細胞自我更新相關(guān)蛋白NANOG（t=5.754，P=0.005）、SOX2（t=6.730，P=0.003）、OCT4（t=11.658，P ＜0.001）和侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP2（t=17.691，P ＜0.001）、波形蛋白（t=9.537，P=0.002）、SLUG（t=5.242，P=0.006）的表達均顯著降低，見圖7。

討 論

圖6 劃痕實驗檢測沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）對A375 細胞遷移能力的影響 6A：劃痕實驗代表性圖片（比例尺=100 μm）；6B：劃痕愈合率統(tǒng)計結(jié)果。a：P ＜0.01

圖7 Western印跡檢測沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）后A375細胞自我更新相關(guān)蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵襲、遷移相關(guān)蛋白（MMP2、波形蛋白、SLUG）的表達水平 7A、7C：代表性電泳圖譜；7B、7D：蛋白相對表達量。a：P ＜0.01；b：P ＜0.001。SOX2：SRY基因相關(guān)的HMG 盒2；OCT4：八聚體結(jié)合蛋白4；MMP2：基質(zhì)金屬蛋白酶2；SLUG：鋅指轉(zhuǎn)錄因子；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

ATAD3A 最早是在小鼠肝細胞線粒體膜上被發(fā)現(xiàn)，隨后證實其定位于線粒體內(nèi)膜，是一種核編碼的線粒體膜蛋白，其基因定位于1號染色體短臂（1p36.33），包含許多與細胞生長有關(guān)的調(diào)控元件，廣泛參與基因的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及胚胎細胞的生長分化等多種生物過程［12-13］。ATAD3A相對分子質(zhì)量約66 000，錨定于線粒體內(nèi)膜和外膜的接觸位點，包含兩個特殊的結(jié)構(gòu)域，即C 端結(jié)構(gòu)域和N 端結(jié)構(gòu)域。C端結(jié)構(gòu)域位于線粒體基質(zhì)，為ATP酶的核心區(qū)域，參與ATP 的合成和水解，并具有與線粒體DNA（mtDNA）結(jié)合的接觸位點，對維持mtDNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要；而N端結(jié)構(gòu)域錨定在線粒體外膜的內(nèi)表面，含多個跨膜區(qū)域，可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等相互作用，對維持線粒體結(jié)構(gòu)、功能以及線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用至關(guān)重要［2-3］。

ATAD3A先前被發(fā)現(xiàn)為c-Myc的靶基因，近年來發(fā)現(xiàn)其異常表達與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，在腫瘤的發(fā)生進展中扮演重要角色［6］。研究顯示，ATAD3A 在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中過表達，與腫瘤分期、組織學分級、生存預后等臨床病理特征密切相關(guān)，其過表達是腫瘤預后不良的標志之一［7-10，14］。國內(nèi)學者也發(fā)現(xiàn)其高表達于子宮內(nèi)膜異位組織，與子宮內(nèi)膜異位組織的種植生長密切相關(guān)［15］。但目前尚無關(guān)于ATAD3A在黑素瘤中研究的報道。

我們首先采用Western印跡檢測ATAD3A在黑素瘤組織中的表達情況，結(jié)果提示，相對于正常癌旁組織，ATAD3A 在黑素瘤組織中高表達。這與ATAD3A在其他惡性腫瘤組織中的表達情況一致，提示ATAD3A 可能作為促癌因子在黑素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生演進中扮演重要角色［7-10，14］。為了進一步研究ATAD3A對黑素瘤惡性表型的影響，本研究采用慢病毒感染方式構(gòu)建穩(wěn)定沉默ATAD3A 的黑素瘤A375細胞系，并探討沉默ATAD3A對A375細胞惡性表型的影響。結(jié)果顯示，沉默ATAD3A 后，A375 細胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯降低，這與既往研究［7，10］結(jié)果一致，即沉默ATAD3A 可抑制肺腺癌細胞和乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。Fang 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ATAD3A 在細胞周期的S 期及血清饑餓時表達明顯增加，提示腫瘤細胞可能通過上調(diào)ATAD3A的表達而增加能量供應，從而為腫瘤細胞在乏氧及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏條件下提供可能的存活機制；Teng 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，ATAD3A 可通過上調(diào)Verprolin 同源結(jié)構(gòu)域包含蛋白3 的表達而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力，因而沉默ATAD3A 可通過影響上述促瘤環(huán)節(jié)而影響腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力。此外，ATAD3A 還是蛋白激酶C 的磷酸化結(jié)合位點、S100B 的結(jié)合蛋白以及哺乳動物西羅莫司靶蛋白、大鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C、細胞周期蛋白Cyclin D1信號通路的調(diào)節(jié)蛋白，這些信號通路均是影響細胞生長和分化的重要調(diào)節(jié)位點，因而其功能的異常與細胞生長及分化密切相關(guān)［7，12，16］。而ATAD3A是否能通過上述機制影響黑素瘤的增殖、侵襲和遷移能力，還需進一步研究。

NANOG、OCT4、SOX2 是一組多能干細胞轉(zhuǎn)錄因子，可促進腫瘤細胞的自我更新能力［17］，且三者均是黑素瘤細胞增殖和成瘤的關(guān)鍵因子，與腫瘤惡性增殖密切相關(guān)［18-19］。MMP2、波形蛋白、SLUG 是一組與黑素瘤腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，可通過降解細胞外基質(zhì)、改變腫瘤細胞黏附能力、促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種過程促進黑素瘤細胞的侵襲和遷移［20-23］。本研究結(jié)果顯示，相比于shCtrl 組，shATAD3A 組 細 胞 中NANOG、OCT4、SOX2、MMP2、波形蛋白、SLUG的表達均明顯減弱，說明沉默ATAD3A可抑制A375細胞上述蛋白的表達。提示沉默ATAD3A 可能通過抑制上述蛋白的表達發(fā)揮抑制細胞增殖、侵襲和遷移的作用，但其機制仍需進一步深入研究。

先前的研究表明，ATAD3A作為ATP酶及控制線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用的關(guān)鍵分子，在控制一些蛋白和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程中扮演重要角色，其表達異常可導致多種蛋白分子和脂質(zhì)因子的合成及分泌異常［3］。研究顯示，在前列腺癌中ATAD3A可通過α1-抗糜蛋白酶調(diào)節(jié)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前列腺特異抗原的分泌而促進前列腺癌的進展［8］。Fang等［7］也發(fā)現(xiàn)，血清饑餓時，肺癌細胞中ATAD3A 表達增加的同時，一些轉(zhuǎn)移和血管生成相關(guān)基因，如肝細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子B及MMP2等的表達也增加。提示ATAD3A 作為線粒體內(nèi)膜上的功能蛋白，其可影響多種促癌蛋白及因子的合成和分泌，從而在腫瘤的進展中發(fā)揮作用。而ATAD3A 是否通過調(diào)節(jié)線粒體及線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的物質(zhì)合成及物質(zhì)交換過程而影響A375 細胞中NANOG、OCT4、SOX2、MMP2、VIMENTIN、SLUG 等表達，還需進一步研究。

本實驗顯示，ATAD3A 在黑素瘤組織中高表達，沉默ATAD3A可抑制黑素瘤A375細胞的增殖、侵襲和遷移能力，ATAD3A可能在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但尚需進一步探討ATAD3A在黑素瘤惡性進展中發(fā)揮作用的潛在分子機制及臨床預后價值。本研究結(jié)果為闡明黑素瘤發(fā)生演進機制、尋找特異性治療靶點提供了理論和實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突