生乳中L-羥脯氨酸含量測定的不確定度評定

李 均，盧 琳，魏 磊

（新疆獸藥飼料監察所，烏魯木齊 830063）

測量不確定度是用以表征合理賦予被測量的值的分散性，是測量結果含有的一個參數。在實際測量過程中，由于測量工具或是測量中各個因素的干擾，測得的結果是以一定的概率分散在某個區域內的多個值，測量不確定度是說明被測量之值分散性的參數。因此在測量的完整表示中應包含測量不確定度，根據實驗室的需要，我們對生乳中L-羥脯氨酸的含量測定進行了測量不確定度的評定。

1 試驗方法及步驟

1.1 稱量及水解

準確吸取均勻的生乳樣品5.00 mL 于水解管中，加入5.00 mL濃鹽酸（優級純）搖勻密封后，置于110 ℃恒溫干燥箱中水解12 h。

1.2 轉移定容

打開水解管，用濾紙過濾到100 mL 容量瓶中，用蒸餾水反復沖洗后定容。

1.3 調節pH

精密量取上述樣品溶液10.00 mL 置三角瓶中，用濃度為10 mol·L-1和1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調節pH 至8±0.2，用水轉移到100 mL 容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液待測。

1.4 標準曲線的配制

精密稱取L-羥脯氨酸對照品50 mg（稱準至0.000 01 g），用0.02 mol·L-1鹽酸溶解并定容至100 mL，得標準儲備液。吸取該標準儲備液1.00 mL于100 mL 容量瓶中，用0.02 mol·L-1鹽酸溶解并定容至刻度，得標準工作液。然后準確吸取標準工作液1.00、2.00、4.00、10.00 和20.00 mL 分別置于100 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻，得到濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50 和1.00 mg·L-1的標準曲線。

1.5 顯色及測定

分別吸取各濃度下的標準曲線溶液和供試品待測溶液各5.00 mL，分別置于25 mL 具塞比色管中，加入氯胺T 溶液2.00 mL，搖勻后于室溫放置20 min，再加入顯色劑2.00 mL，搖勻，蓋上塞子于60 ℃恒溫水浴鍋中加熱20 min 后取出，迅速冷卻，用紫外分光光度計在560 nm 波長處測定吸光度值，并以標準溶液濃度值為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

2 數學模型

樣品中L-羥脯氨酸的含量以質量濃度X計（mg·L-1），按下式計算：

其中，c：從標準曲線上查得的濃度（mg·L-1）；V1：吸取樣品的體積（mL）；V2：樣品水解后的定容體積（mL）；V3：吸取水解液的體積（mL）；V4：水解液調完pH后定容的體積（mL）。

3 各分量標準不確定度的評定

3.1 測量重復性的相對標準不確定度（A 類評定：標準差法）

為得到可靠性較高的結果，進行8份樣品的平行測量，所得測量數據見表1。

表1 測量重復性的相對標準不確定度mg·L-1

利用上述數據，按照貝塞爾公式計算得單次測量的標準偏差為：

則以平均值作為測量結果時的實驗標準差，即測量重復性的相對不確定度為：

3.2 標準曲線的標準不確定度

3.2.1 繪制標準曲線

為制作校準曲線，本次測量配制了6個不同濃度 的 標 準 溶 液c0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·L-1，對應的吸光度A分別為0.003、0.028、0.055、0.102、0.219和0.427。

用最小二乘法進行線性擬合，得標準曲線1次方程為：A-A0=0.4189c+0.0098，其相關系數r=0.9995。

3.2.2 標準曲線的標準不確定度

由于擬合直線本身具有不穩定性，用擬合直線計算樣品中L-羥脯氨酸的含量所引入的標準不確定度按下式計算：

其中：p-試樣平行測量次數；n-擬合直線的數據對總數；s(y)-單次測量的標準偏差；b-擬合曲線的截距；y-試樣測量響應值（p個）的平均值；yˉ-繪制曲線響應值（n個）的平均值；Ci-繪制曲線用某標準溶液濃度值；Cˉ-繪制曲線用某標準溶液濃度輸入值（n個）的平均值；Cs-從曲線上測得的樣品中L-羥脯氨酸含量的平均值。

p=2，n=12，b=0.4189，yˉ=0.139，C=0.142，將這些數據代入公式（2）計算得到由標準曲線引入的標準不確定度：u(Cs)=0.631 mg·L-1。其相對不確定度為：

3.3 紫外分光光度計引入的標準不確定度

紫外分光光度計檢定證書上說明在400～700 nm（由于本次測量波長為560 nm）范圍校準的最大允許誤差為0.55%，其包含因子k=2，則其標準不確定度為：

3.4 吸取樣品的移液管相對標準不確定度

用5 mL的單標線吸管吸取5.00 mL(v1)，根據檢定規程JJG-196-2009中的《常規玻璃量具》說明，5 mL A級單標線吸管的允許誤差為±0.015mL，同樣假定為三角形分布，其包含因子k=，則其相對標準不確定度為：

3.5 定容體積測量的相對標準不確定度

吸取試樣水解后，轉移至100 mL(v2)A 級容量瓶中定容，根據檢定規程JJG-196-2009中的《常規玻璃量具》說明，100 mL A 級容量瓶的允許誤差為±0.10 mL，假定為三角形分布，其包含因子k=，則其相對標準不確定度為：

3.6 分取體積的移液管相對標準不確定度

用10 mL的單標線吸管吸取10.00 mL(v3)，根據檢定規程JJG-196-2009 中的《常規玻璃量具》說明，10 mL A級單標線吸管的允許誤差為±0.020 mL，同樣假定為三角形分布，其包含因子k=，則其相對標準不確定度為：

4 合成不確定度

將各分量的相對標準不確定度匯總于表2。

表2 輸入量及其相對標準不確定度

計算氟苯尼考含量X的合成標準不確定度為：

5 擴展不確定度

取擴展銀子k=2，得擴展不確定度為：

6 測量不確定度報告

測定結果：含量（mg·L-1）=5.79±1.308（±符號后為擴展不確定度，k=2，p=95%）。

7 討論與結論

本文對生乳中L-羥脯氨酸的含量測定進行測量不確定度的評定，對6個影響分量計算各相對標準不確定度，得到合成標準不確定度為0.654（mg·L-1），算出本試驗的擴展不確定度為1.308（mg·L-1）。通過評定不確定度，了解檢測過程中的各影響因素，以減少其在試驗過程中的影響。

其次，當檢測結果處于檢測邊緣的時候，不同檢測單位檢測結果會存在一定的偏差，由于檢測結果處于臨近狀態，使檢測結果超出檢測標準要求。如果進行檢測結果不確定度的評定，給出不確定度值就可避免一些不必要的誤差。最后，開展好測量不確定度的評定，是實驗室提高出具檢驗結果可靠性的重要保障，也是實驗室科學性、準確性和專業技術水平的體現。