昆明犬PPARGC1A基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

李 靜，萬(wàn)九生，鄧衛(wèi)東，陳 超*，岳 銳，黎立光

（1.公安部昆明警犬基地，昆明 650201；2.公安部警犬技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，昆明 650201）

過(guò)氧化物酶體增殖激活受體共激活劑也稱為PGC1A（PPARGC1A基因），是由Puigserver 等作為新的轉(zhuǎn)錄共激活劑核受體的PPARG（過(guò)氧化物酶體增殖的激活受體），由脂肪細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)器分化而被檢測(cè)到[1]。PPARGC1A做為核受體在轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性產(chǎn)熱鏈接中起著關(guān)鍵作用。適應(yīng)性產(chǎn)熱作用在體重調(diào)節(jié)和預(yù)防肥胖中起著重要的作用[2-3]。自適應(yīng)產(chǎn)熱至少包括三個(gè)可分離的過(guò)程：特異性解偶聯(lián)蛋白（UCP）的表達(dá)、呼吸系統(tǒng)線粒體酶的表達(dá)鏈和線粒體的生物發(fā)生。PPARGC1A已經(jīng)被證明可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄UCP1、UCP2和UCP的mRNA，其啟動(dòng)子解偶聯(lián)蛋白中含有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)PPARG 以及THRB[4]。這兩種受體都被激活與PPARGC1A相互作用[5]。過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α（PPARA）是編碼線粒體脂肪酸β-氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄控制中的關(guān)鍵蛋白，PPARA的調(diào)節(jié)途徑也與肥胖和糖尿病有關(guān)[6]。在肌肉細(xì)胞中，PPARGC1A誘導(dǎo)SLC2A4的表達(dá)（溶質(zhì)載體家族2 成員4）[7]，小鼠和人PPARGC1A的表達(dá)是通過(guò)β-腎上腺素受體途徑的冷暴露誘導(dǎo)的[8-9]。人PPARGC1A活性的調(diào)節(jié)是通過(guò)與阻遏物的MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）敏感相互作用來(lái)控制的[10]。PPARGC1AmRNA已在高能量需求且富含脂肪的組織中發(fā)現(xiàn)，如心臟、骨骼肌、褐色脂肪、腎臟、肝臟和大腦[11-13]。考慮到PPARGC1A蛋白的多功能該基因可視為肉品質(zhì)性狀的功能候選基因[3]。

目前國(guó)內(nèi)外主要PPARGC1A基因針對(duì)的研究多集中在人、豬、牛上，犬上研究的較少。鑒于此，本研究以昆明犬為研究對(duì)象，采用RT-PCR技術(shù)通過(guò)對(duì)昆明犬PPARGC1A基因克隆的分析，確定PPARGC1A的序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為警犬的肌肉形成機(jī)理和產(chǎn)能等影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

以公安部昆明警犬基地昆明犬為研究對(duì)象。試驗(yàn)采集于。犬只麻醉后，選擇1歲昆明犬臀大肌取一小塊組織塊于1.5 mL 凍存管中，立即置于液氮中，隨后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜赗NA 的提取。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試驗(yàn)器材

Eppendorf 各量程移液器、湘儀L550 低速大型離心機(jī)、湘儀H1650-W 小型高速離心機(jī)、君意JY04S-3C 凝膠成像儀、君意JY02 紫外透視儀、君意JY300C 電泳儀、ABI 2720 PCR 儀、ABI 3730xl遺傳分析儀、博日HB-T2-D 金屬浴加熱儀，天平、漩渦震蕩儀、水平震蕩儀，槍頭，96孔反應(yīng)板等。

1.2.2 試驗(yàn)試劑

I- 5 2X High- Fidelity Master Mix（Tsingke；TP001-1）、Tsingke Agarose、DNA 凝膠回收試劑盒、DL2000 Marker、pClone007 Versatile Simple Vector Kit、瓊脂糖、蛋白胨、酵母粉、TBE、EB、無(wú)水乙醇、BDT 原液、buffer（BDT 稀釋用）、甜菜堿、滅菌高純水、樣品、稀釋過(guò)的引物、無(wú)菌高純水、Magical Buffer、Ferrite Bead。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參 考GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中PPARGC1A基因序列（登錄號(hào)：XM_014112658.2）cDNA 引物，用Premier 5 設(shè)計(jì)出擴(kuò)增引物1對(duì)。由擎科生物合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 總RNA的提取

取適量液氮研磨成粉的樣品到1.5 mL eppen?dorf管，加入1 mL Trizol試劑，混勻；按TRIzol：氯仿5:1 的比例加入氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置3 min；4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min；吸取上清至另1新的1.5 mL eppendorf管，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置20 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min 后，去上清；加入至少1 mL 4 ℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀；4 ℃，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清；4 ℃，10 000 r·min-1再次離心5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）；加入20 μL RNase-free水，至完全溶解，取1 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA產(chǎn)物

以擎科金牌逆轉(zhuǎn)率試劑盒Goldenstar RT6 cD?NA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，按表2組分進(jìn)行加樣。

表2 PCR反應(yīng)體系

以上加樣混勻后按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：

25 ℃，10 min

50 ℃，30 min

85 ℃，5 min

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上或冷藏備用。

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL，其中含DNA 模板1 μL、酶mix25 μL、正反向引物（10 μmol·L-1）各2 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸5 min。

1.7 PCR產(chǎn)物切膠純化步驟

試驗(yàn)準(zhǔn)備：核對(duì)切膠記錄與樣品板中是否相符、有無(wú)特殊注意事項(xiàng)；確保Buffer W1、Buffer W2中加入了無(wú)水乙醇。

操作步驟：補(bǔ)水加loading buffer：按照（樣品：6×Loading buffer=5:1）加入10 μL 6×Loading buffer。

點(diǎn)純化膠：將樣品點(diǎn)入事先準(zhǔn)備好的1%的純化膠中。

電泳：電泳儀電壓設(shè)定160 V接上接頭正負(fù)極恒壓電泳40～60 min，開始電泳后要觀察純化膠槽正負(fù)極有氣泡冒出后，定時(shí)。

采集圖像：將膠塊放入凝膠成像儀器中采集圖像。

切膠：在長(zhǎng)波365 nm 紫外透射儀下，用手術(shù)刀切下目的條帶，切取的膠塊質(zhì)量應(yīng)<3 g，將其放入對(duì)應(yīng)的板孔號(hào)中。

溶膠： 純化板配平4 000 r·min-1離心1 min，加入500 μL Buffer GL，蓋上封口膜，65 ℃水浴12～15 min。

加磁珠：檢查每孔膠塊是否完全溶解，若沒(méi)有完全溶解再次65 ℃水浴3 min，揭開封口膜，用連續(xù)加液器每孔加入10 μL 混勻的磁珠，蓋上硅膠墊，漩渦震蕩30 s，轉(zhuǎn)入水平震蕩儀600～800 r·min-1震蕩5 min。

純化：

①將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3次，再次靜置磁吸1 min；

②棄廢液，吸水紙上輕磕，用50～1 200 μL 8道電動(dòng)移液器向每孔移取500 μL Buffer W1，蓋上硅膠墊漩渦震蕩30 s，將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3次，再次靜置磁吸1 min；

③棄廢液，吸水紙上輕磕，用50～1 200 μL 8道電動(dòng)移液器向每孔移取500 μL Buffer W2 蓋上硅膠墊漩渦震蕩30 s，將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3次，再次靜置磁吸1 min；

④棄廢液，吸水紙上輕磕，倒離心至600 r·min-1。

洗脫：取下磁力架，加入35 μL 的Eluent（已65 ℃水浴加熱），蓋上封口膜，放入水平震蕩儀上600～800 r·min-1，震蕩5 min，震蕩完成后離心至1 000 r·min-1，將96孔板卡入磁力架中，磁吸1 min。

點(diǎn)鑒定膠：2 μL樣品+6 μL 0.5×溴酚藍(lán)混合后點(diǎn)入0.8%的鑒定膠中，300 V電泳12 min。

采集圖像：將鑒定膠放入凝膠成像儀中采集圖像。

鑒定：對(duì)照純化前后膠圖，根據(jù)PCR 定量標(biāo)準(zhǔn)在PCR 記錄表上標(biāo)注每孔模板濃度并稀釋至指定濃度。

1.8 克隆及測(cè)序

連入載體：連接反應(yīng)體系：其中含有5×pClone007 VS mix2 μL，PCR 產(chǎn)物8 μL，ddH2O 補(bǔ)至10 μL。

連接反應(yīng)：室溫（22～30 ℃）反應(yīng)1～5 min。

轉(zhuǎn)化：

①使用擎科TreliefTM5α Chemically Competent Cell進(jìn)行快速轉(zhuǎn)化。

②取100 μL 冰上融化的TreliefTM5α Chemical?ly Competent Cell 感 受 態(tài) 細(xì) 胞， 加 入10 μL pClone007 VS連接產(chǎn)物，輕輕吹打攪拌混勻后冰上靜置5 min。

③42 ℃水浴熱激45 s，迅速移至冰浴中，靜置2 min。

④涂布平板：向離心管中加入500 μL 無(wú)抗性LB 培養(yǎng)液，無(wú)需復(fù)蘇，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求直接吸取不同體積均勻涂布到含Amp 抗生素的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

⑤挑取單克隆：按正常處理平板的步驟挑取單克隆，搖菌提質(zhì)粒。

擴(kuò)增鑒定后挑選出含有正確目的基因的菌液，送往擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.9 生物信息學(xué)分析

用ContigExpress拼接測(cè)序結(jié)果。

用拼接好的結(jié)果在NCBI 里比對(duì)查找出Homo sapiens人、Mus musculus小家鼠、Mus caroli卡氏小鼠、Sus scrofa歐亞野豬、Bos mutus野牦牛、Bos taurus牛、Canis lupus familiaris家犬、vulpes赤狐PPARGC1A基因序列。

將查找到的序列用BioEdit 進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，并用clustalx對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

將比對(duì)結(jié)果用MEGA的Neighbor Joining模式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)樹進(jìn)行編輯優(yōu)化。

將所有序列用MegAlign進(jìn)行同源性比對(duì)。

多序列比對(duì)分析利用BioEdit 軟件進(jìn)行，開放閱讀框分析通過(guò)在線分析工具ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）實(shí)現(xiàn)。

利用NCBI 服務(wù)器上的Conserved Domains 的CD-Search工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc?ture/cdd/ wrpsb.cgi）獲取蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。蛋白的理化性質(zhì)分析（相對(duì)分子質(zhì)量、理論pI值、氨基酸組成及半衰期等）通過(guò)在線軟件ExPASy-Prot?Param 工具（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)。疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，蛋白的疏水性分析通過(guò)ExPASy-ProtScale 工具（https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行。信號(hào)肽分析通過(guò)在線分析工具Signal P 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行。亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì)功能存在重要的聯(lián)系，亞細(xì)胞定位分析通過(guò)在線分析工具PSORT II（https：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行。使用TMHMM 軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)。利用SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）預(yù)測(cè)的IGF-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用瑞士生物信息研究院（Swiss Institute of Bioinformatics,SIB）的專業(yè)蛋白分析系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）服務(wù)器（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆明犬PPARGC1A基因的克隆

提取昆明犬肌肉組織總RNA，并反轉(zhuǎn)構(gòu)成cDNA，經(jīng)過(guò)PCR 鑒定（1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 、45 min）電泳觀察發(fā)現(xiàn)，片段大小約2 246 bp（見(jiàn)圖1），與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明引物特異性良好，可以進(jìn)行下一步研究。

2.2 昆明犬PPARGC1A 基因的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果顯示，昆明犬PPARGC1A基因cds 區(qū)全長(zhǎng)2 246 bp，共編碼個(gè)724 個(gè)氨基酸。運(yùn)用MegAlign 對(duì)昆明犬和其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果與家犬（登錄號(hào)：XM_014112658.2）、赤狐（登錄號(hào)：XM_025997319.1）、野牦牛（登錄號(hào)：XM_005897079.2）、牛（登錄號(hào)：NM_177945.3）、人（登錄號(hào)：NM_013261.5）、家鼠（登錄號(hào)：NM_008904.2）、 卡 氏 小 鼠（ 登 錄 號(hào)： XM_021162167.2）、 歐 亞 野 豬（登 錄 號(hào)： NM_213963.2）、同源性分別為100%、99.6%、95%、95%、95.4%、91.7%、91.6%、95%（見(jiàn)圖2）。

圖1 昆明犬PPARGC1A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖2 昆明犬PPARGC1A基因與其他物種同源性比對(duì)

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果，與家犬、赤狐聚為1支，與其他養(yǎng)脊椎動(dòng)物相分離，表明其在進(jìn)化上與犬類的親緣關(guān)系較近。與豬、牛、人關(guān)系次之，與小鼠關(guān)系最遠(yuǎn)，該基因在哺乳動(dòng)物中較為保守（見(jiàn)圖3）。

2.3 PPARGC1A基因編碼氨基酸理化特性的分析

根據(jù)在線軟件ExPASy-ProtParam 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PPARGC1A基因編碼蛋白的分子質(zhì)量80 971.82 ku，理論等電點(diǎn)pI 為11.20。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）：30 個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg +Lys）：100 個(gè)，表示這個(gè)蛋白可能帶正電荷。分子式為C3549H5835N1069O997S48，原子總數(shù)：11 498。序列的N 端是W（Trp），預(yù)計(jì)半衰期：2.8 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外）>3 min（酵母，體內(nèi)）>2 min（大腸桿菌，體內(nèi)）。不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為59.16，這表明PPARGC1A基因編碼蛋白質(zhì)分類為不穩(wěn)定的。脂肪指數(shù)81.60，平均親水系數(shù)為（GRAVY）：-0.336，表明此蛋白親水性差，脂溶性強(qiáng)。在組成昆明犬PPARGC1A基因編碼20 種氨基酸中，亮氨酸Leu（L）占比最高為11.3%。

2.4 昆明犬PPARGC1A蛋白疏水性分析

PPARGC1A蛋白的疏水性分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 昆明犬PPARGC1A基因與其他動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)生樹分析

表3 昆明犬PPARGC1A基因編碼氨基酸組成分析

圖4 中分值>0 表示氨基酸疏水，<0 表示氨基酸親水，氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)，分值越低親水性越強(qiáng)，昆明犬PPARGC1A蛋白在第683氨基酸處具有疏水最大值3.15636，在第627 氨基酸處具有疏水最小值-2.956。

2.5 昆明犬PPARGC1A蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

昆明犬PPARGC1A 蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位見(jiàn)表4。

表4 昆明犬PPARGC1A蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

2.6 昆明犬PPARGC1A 蛋白跨膜信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用Signal P 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/servic?es/SignalP/）在線預(yù)測(cè)，D=0.45是區(qū)分是否是信號(hào)肽的標(biāo)志，昆明犬PPARGC1A 蛋白預(yù)測(cè)D 值=0.629，因此是一個(gè)分泌性蛋白，預(yù)測(cè)的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在第23和24位氨基酸之間（見(jiàn)圖5）。

利用在線TMHMM-2.0分析發(fā)現(xiàn)PPARGC1A蛋白存在1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖6）。跨膜位置處于第666 和第688 位氨基酸處，前665 位氨基酸處于膜外，第689至724位氨基酸處于膜內(nèi)。

2.7 昆明犬PPARGC1A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖7可知，利用SOPMA程序預(yù)測(cè)PPARGC1A蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，共724 個(gè)AA 中含α 螺旋（Hh）203AA（28.04%），延伸鏈（Ee）120個(gè)AA（20.99%），β轉(zhuǎn)角（Tt）49 個(gè)AA（6.77%）和無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）352個(gè)AA（48.62%），昆明犬PPARGC1A蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖8，全局模型質(zhì)量估計(jì)值為0.64，序列相似性為65.73%，認(rèn)為所建立的三維結(jié)構(gòu)模型較為準(zhǔn)確。

圖5 昆明犬PPARGC1A蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖6 昆明犬PPARGC1A蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 利用SOPMA程序預(yù)測(cè)的昆明犬PPARGC1A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖8 預(yù)測(cè)昆明犬PPARGC1A蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

過(guò)氧化物酶體增殖激活受體伽瑪共激活劑1-alpha（PPARGC1A）是一個(gè)在肌肉和脂肪形成中起著關(guān)鍵脂質(zhì)代謝作用的候選基因[14]。控制一個(gè)基因陣列的表達(dá)從而影響葡萄糖和脂肪酸代謝[15]。該基因大量存在于肌肉、棕色脂肪和大腦以及有助于脂肪生成和脂肪細(xì)胞分化組織[16-18]。身體的肥胖是由于食物攝入和能量消耗之間的不平衡造成的。適應(yīng)性生熱響應(yīng)、低溫和過(guò)度進(jìn)食可能導(dǎo)致肥胖。Puigserver P 將小鼠持續(xù)暴露于低溫環(huán)境，增強(qiáng)適應(yīng)性生熱響應(yīng)（BAT）和Pgc1 mRNA的表達(dá)。小鼠白色脂肪細(xì)胞中Pgc1的表達(dá)誘導(dǎo)UCP1基因轉(zhuǎn)錄激活表達(dá)UCP1，UCP 基因家族的成員僅在BAT 中使用，并通過(guò)耗散跨內(nèi)線粒體膜的電化學(xué)梯度來(lái)進(jìn)行ATP 合成，產(chǎn)生熱量[19]。對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究表明，體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存可以調(diào)節(jié)[20]。成年人類沒(méi)有明確定義的BAT 沉積物，但UCP1 mRNA 表達(dá)在白色脂肪組織中也可以檢測(cè)到，表明棕色脂肪細(xì)胞散布在白色脂肪細(xì)胞中。

為進(jìn)一步了解PPARGC1A 在UCP1 和其他線粒體組織特異性表達(dá)中的作用蛋白質(zhì)及其影響犬的肌肉形成機(jī)理和產(chǎn)能等，本研究獲得了昆明犬的PPARGC1A 基因cDNA 序列。昆明犬PPARGC1A 基因全長(zhǎng)2 246 bp，共編碼個(gè)724 個(gè)氨基酸。與參考序列家犬（登錄號(hào)：XM_014112658.2）同源性為100%。與赤狐（登錄號(hào)：XM_025997319.1）、野牦牛（登錄號(hào)：XM_005897079.2）、牛（登錄號(hào)：NM_177945.3）、人（登錄號(hào)：NM_013261.5）、家鼠（登錄號(hào)：NM_008904.2）、卡氏小鼠（登錄號(hào)：XM_021162167.2）、歐亞野豬（登錄號(hào)：NM_213963.2）、同源性分別為99.6%、95%、95%、95.4%、91.7%、91.6%、95%。昆明犬PPARGC1A基因編碼蛋白的分子質(zhì)量為80 971.82 ku，理論等電點(diǎn)pI 為11.20。人的PPARGC1A 基因跨越67 kb 的區(qū)域，由13個(gè)外顯子組成，并編碼一種91-ku蛋白質(zhì)，與鼠具有94%的氨基酸同源性。 人類中已轉(zhuǎn)錄的mRNA 種類來(lái)自無(wú)TATA 啟動(dòng)子的序列分別為6.4和5.3 kb，被映射到染色體4p15.1[14]。豬PPARGC1A基 因（GenBank NO. NW_003540975.1 和 NM_213963.1）定位于8 號(hào)染色體以下位置的p2.1-p2.3，包含13 個(gè)外顯子，其90 bp 為50-UTR。編碼區(qū)大小為2 388 bp，編碼796 個(gè)氨基酸[21-22]。豬PPARGC1A 基因編碼的氨基酸序列與人類，大鼠，小鼠的同源性也較高。該基因在上述物種中高度同源性物種強(qiáng)烈暗示著該基因編碼不同的生物體作為適應(yīng)熱原中的核心蛋白[23-25]。平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.336，表明此蛋白親水性差，脂溶性強(qiáng)。在組成昆明犬PPARGC1A 基因編碼20 種氨基酸中，亮氨酸Leu（L）占比最高，比例為11.3%。本研究還利用生物信息學(xué)分析工具對(duì)昆明犬PPARGC1A 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，含α 螺旋、延伸鏈、β 轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能及用于昆明犬分子育種打下良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用分子克隆技術(shù)獲得了昆明犬PPARGC1A基因的編碼區(qū)序列并進(jìn)行序列分析，以期為進(jìn)一步研究昆明PPARGC1A基因的表達(dá)調(diào)控及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)昆明犬的重要功能奠定一定的基礎(chǔ)。