嗎啡對(duì)成體小鼠齒狀回新生顆粒細(xì)胞成熟的影響

曾林

(成都中醫(yī)藥大學(xué)屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都)

0 引言

神經(jīng)發(fā)生位于大腦的海馬、室下區(qū)56和嗅球等區(qū)域并貫穿終生。在海馬，顆粒層細(xì)胞作為神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞形成新的神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)獨(dú)特的成熟方式，將新生的神經(jīng)突起與原來(lái)的神經(jīng)通路整合并參與海馬的功能，包括學(xué)習(xí)和記憶[1,2]。藥物成癮或藥物依賴(lài)是一種慢性復(fù)發(fā)性腦疾病，而神經(jīng)干細(xì)胞所在的主要區(qū)域海馬，也是藥物成癮相關(guān)腦區(qū)之一[3]。現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示，嗎啡能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，嗎啡與阿片受體(MOR-1及KOR-1)的結(jié)合，可激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，通過(guò)ERK/MAP激酶信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化；嗎啡亦可通過(guò)大麻素CB1受體和脂肪酰胺水解酶這一途徑，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖與分化；亦有研究發(fā)現(xiàn)慢性嗎啡處理大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元樹(shù)突棘密度、樹(shù)突分支長(zhǎng)度等形態(tài)改變[4]。但目前，對(duì)嗎啡在海馬神經(jīng)干細(xì)胞的影響作用，研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用Maldonado等建立的劑量遞增間斷皮下給藥方法建立的嗎啡依賴(lài)動(dòng)物模型[3]，應(yīng)用免疫熒光染色方法，檢測(cè)嗎啡依賴(lài)小鼠海馬齒狀回顆粒層細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)變化，借以了解嗎啡對(duì)海馬新生神經(jīng)元發(fā)生的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇小鼠12只(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)04046)，月齡2～3月，體質(zhì)量25～30g。按隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2組：對(duì)照組、嗎啡依賴(lài)組，每組各6只，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，室溫24 ℃，自然晝夜循環(huán)非直接光照條件下籠養(yǎng)，進(jìn)食飲水自由。藥品與試劑：鹽酸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠)；一抗抗DCX抗體Doublecortin antibody - Neuronal Marker(ab18723)rabbit(Millipore公司)，二抗donkey antirabbit IgG，(Fluor 488，catalogue No. A-11017；Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)。細(xì)胞核DAPI染色(c1002，Beyotime公司)。儀器與器材：切片機(jī)(LM30503)，熒光顯微鏡(Leica DC500，DMRXA2)數(shù)碼相機(jī)(日本OLYMPUS)，Zeiss LSM數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。(所有作者均參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和評(píng)估，實(shí)驗(yàn)的實(shí)施主要由第一作者完成，實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)。)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組模型制備

模型制作參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組每天兩次在背部皮下注射鹽酸嗎啡，首日10mg/kg，隔2日每次增加10mg/kg，至第12日末次注射50mg/kg。嗎啡依賴(lài)組末次注射后6h麻醉下灌注固定。對(duì)照組小鼠按照同期平行對(duì)照的原則，以相同方式注射同體積的生理鹽水。記錄小鼠在正常及實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下的活動(dòng)狀況。

2.2 標(biāo)本制備

采用7%苯妥英鈉麻醉小鼠，將其固定四肢于泡沫板上。剪開(kāi)胸腔，暴露心臟。輸液器針頭刺入左心室，剪開(kāi)右心耳至心房部位，PBS灌注，至沖出的液體無(wú)色，4%PF灌注約10至20分鐘即可。取出大腦，4%福爾馬林固定24小時(shí)，30%糖水脫水24小時(shí)，進(jìn)行冰凍切片。切片的厚度為16nm。神經(jīng)微管相關(guān)蛋白免疫熒光染色法(Doublecortin，DCX)：從冰箱里取出切片，PBS洗2次每次10分鐘，加入PBS-Triton30分鐘，加一抗Doublecortin Antibody(1：100)，4℃冰箱過(guò)夜。PBS洗三次，每次10分鐘。加入二抗熒光(Donkey Anti Rabbit 555，1：100)，室溫孵育1小時(shí)。PBS洗三次，晾干，封片。

2.3 主要觀察指標(biāo)

海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元數(shù)目及神經(jīng)突突起數(shù)目及突起長(zhǎng)度，未能夠到達(dá)分子層(Molecular Layer，ML)的無(wú)效細(xì)胞數(shù)目。采用Zeiss LSM數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，計(jì)算每個(gè)DCX陽(yáng)性細(xì)胞突起(包括直接突起和間接突起)的數(shù)目和長(zhǎng)度，每張圖片像素一致(1300×1030)，長(zhǎng)度單位為軟件設(shè)置單位。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 嗎啡對(duì)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞發(fā)生的影響

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程未出現(xiàn)小鼠異常死亡，嗎啡注射的所有動(dòng)物均成功建成嗎啡依賴(lài)動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)鼠行為表現(xiàn)：對(duì)照組小鼠平時(shí)安靜不動(dòng)，皮下注射生理鹽水時(shí)表現(xiàn)為掙扎、撕咬等。嗎啡依賴(lài)組早期皮下注射嗎啡時(shí)表現(xiàn)為精神緊張、掙扎等；在嗎啡注射6～10d實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、進(jìn)食量下降、皮毛無(wú)光澤，注射時(shí)較對(duì)照組安靜，但注射后活動(dòng)明顯增加，體重出現(xiàn)不同程度的減輕。

免疫熒光染色：可以清晰地看到海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元胞質(zhì)和突起呈綠色熒光(圖1)。實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，嗎啡依賴(lài)組DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P=0.0016)；嗎啡組有突起細(xì)胞的數(shù)目(P=0.004)、神經(jīng)干細(xì)胞突起(包括直接突起和間接突起)的數(shù)目和長(zhǎng)度(P＜0.001，P＜0.001)均顯著增加；嗎啡依賴(lài)組無(wú)效神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比即有效新生神經(jīng)細(xì)胞的比例(P=0.0012)顯著增加。

結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 成體小鼠海馬DCX免疫熒光染色，對(duì)照組(A)、實(shí)驗(yàn)組(B)

4 討論

海馬是參與空間學(xué)習(xí)與記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，在中樞信息傳遞和整合過(guò)程中起到非常重要的作用，也是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的高級(jí)中樞和應(yīng)激免疫的易損部位[1,3]，多年來(lái)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的焦點(diǎn)。在藥物依賴(lài)的形成中，海馬是成癮相關(guān)腦區(qū)之一，參與成癮的認(rèn)知功能障礙和記憶力損害[3]。海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生對(duì)海馬依賴(lài)性的學(xué)習(xí)記憶功能有密切的關(guān)系。海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)基本由顆粒神經(jīng)元構(gòu)成，目前研究較多的是DG的神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象，DG區(qū)的顆粒細(xì)胞層早在胚胎期就已形成，但成年以后也同樣保留了一定的神經(jīng)元發(fā)生能力[5]。新生神經(jīng)元發(fā)育產(chǎn)生軸樹(shù)突并建立突觸聯(lián)系等，這個(gè)過(guò)程極易受個(gè)體所處外界環(huán)境和病理因素的影響，使得海馬區(qū)結(jié)構(gòu)具有極大的適應(yīng)性和可塑性[6]。研究表明，在豐富環(huán)境中生活一段時(shí)間之后，成年小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元的凈增長(zhǎng)顯著增加，同時(shí)伴有空間學(xué)習(xí)能力明顯增強(qiáng)，某些技能的學(xué)習(xí)也能起到相似作用[1,5]。但未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出在藥物依賴(lài)的形成過(guò)程中藥物是否對(duì)神經(jīng)發(fā)生有著同樣的影響作用。

神經(jīng)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的自我復(fù)制及產(chǎn)生多種不同類(lèi)型子細(xì)胞的能力，許多因素可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向不同的神經(jīng)細(xì)胞分化。神經(jīng)干細(xì)胞完成向神經(jīng)元的定向分化是一個(gè)細(xì)胞從幼稚到成熟的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中必然伴有細(xì)胞形態(tài)的變化。在成體內(nèi)，新生成的神經(jīng)干細(xì)胞或/和祖細(xì)胞由室下區(qū)遷徙而來(lái)，形成內(nèi)層顆粒細(xì)胞，并發(fā)出新的樹(shù)突和軸突與現(xiàn)有的海馬神經(jīng)通路整合，參與學(xué)習(xí)和記憶等功能重構(gòu)。嚙齒動(dòng)物的神經(jīng)元通常只會(huì)發(fā)起一個(gè)主要的突起，然后再分支形成樹(shù)枝狀突起。7天的神經(jīng)細(xì)胞突起開(kāi)始接近分子層(ML)并發(fā)出分支，與原來(lái)的神經(jīng)通路整合。如果未到達(dá)ML，新生成的神經(jīng)突起不能與原有的細(xì)胞突起形成突觸，因此不能參與到原有的神經(jīng)通路中，這種細(xì)胞即為無(wú)效細(xì)胞。以往文獻(xiàn)報(bào)道影響海馬神經(jīng)干細(xì)胞的因素很多，包括各類(lèi)神經(jīng)因子以及信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[1,6]。本實(shí)驗(yàn)采用嗎啡劑量遞增間斷皮下給藥方法建立嗎啡依賴(lài)動(dòng)物模型，借以了解嗎啡對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)觀察到小鼠多在3～4d即表現(xiàn)出嗎啡依賴(lài)癥狀，小鼠行為學(xué)改變和腦組織鏡檢結(jié)果證實(shí)我們的動(dòng)物模型成功建立。在此動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)首次采用目前衡量神經(jīng)發(fā)生的特異標(biāo)志之一的微管蛋白(Tubulin)檢測(cè)了成體小鼠海馬DG顆粒層內(nèi)新生神經(jīng)元的形態(tài)特征，包括顆粒層神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、有神經(jīng)突起的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和神經(jīng)突的數(shù)目、長(zhǎng)度，以及將突起伸至ML的細(xì)胞比例。

微管蛋白是細(xì)胞生發(fā)的標(biāo)志蛋白，是構(gòu)成微管的重要成分。微管是細(xì)胞骨架中最粗的一種纖維絲，是細(xì)胞內(nèi)囊泡、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)交通運(yùn)輸?shù)能壍溃湓诨畹募?xì)胞內(nèi)是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，在一定條件下有聚合與解聚的過(guò)程，因此在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)了各種形狀的排列方式，以適應(yīng)變動(dòng)的細(xì)胞質(zhì)狀態(tài)和完成它們的各種功能[3]。微管蛋白在新生鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞可以持續(xù)表達(dá)四周，參與神經(jīng)元的定向分化過(guò)程。

我們的結(jié)果顯示，嗎啡能夠顯著增加海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化并形成顆粒層新的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元突起數(shù)目增加，突起的長(zhǎng)度也有顯著的增加。與此同時(shí)，到達(dá)ML區(qū)的有效新生神經(jīng)元比例增加。我們也觀察到微管蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元過(guò)程中發(fā)生了表達(dá)的變化。用免疫熒光方法觀察，在分化初期，微管蛋白陽(yáng)性反應(yīng)明顯分布于核周，較密集排列，隨神經(jīng)元分化的逐漸成熟，微管蛋白散在分布于胞質(zhì)中，組成網(wǎng)狀，可以伸入到突起內(nèi)。研究結(jié)果顯示，神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)由幼稚到成熟的變化，是與微管蛋白的分布位置變化相一致的，微管蛋白由核周到胞質(zhì)的遷移，使其維持的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，同時(shí)也證明了微管組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)隨細(xì)胞周期各時(shí)期的變化而起變化的觀點(diǎn)[4,6]。因此，我們認(rèn)為，嗎啡依賴(lài)小鼠引起DG區(qū)顆粒細(xì)胞數(shù)目增多的機(jī)制在于提高了新生顆粒神經(jīng)元的存活率。

實(shí)驗(yàn)證明，在成體海馬神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中，嗎啡能夠通過(guò)影響海馬神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)成熟和遷移，增殖分化成更多的有效神經(jīng)元，形成更多的突觸并整合入原來(lái)的神經(jīng)通路，從而參與藥物依賴(lài)及戒斷癥狀的形成過(guò)程。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)嗎啡能夠促進(jìn)海馬顆粒細(xì)胞凋亡的研究，推測(cè)嗎啡能夠影響海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化和凋亡。更加深入的功能研究，以及長(zhǎng)期的嗎啡處理是否仍能保持這一作用，值得進(jìn)一步的探討。