FAT1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

徐詠強(qiáng)，葉偉標(biāo)，周嬋，陳靖，李妤玲，何建芳

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院，廣東東莞523000

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在歐美等西方發(fā)達(dá)國家惡性腫瘤疾病總發(fā)病率中位居第3[1]。現(xiàn)階段，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高，主要與人們生活水平及飲食結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，盡管采取積極的綜合治療手段，中晚期結(jié)直腸癌特別是伴有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者5年生存率仍無顯著的改善，所以應(yīng)重視結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)理的研究，確定腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲治療靶點。脂肪非典型鈣黏蛋白1（FAT1）是一種鈣離子依賴的單向跨膜受體蛋白，其結(jié)合不同蛋白可參與一系列生物學(xué)行為，如細(xì)胞遷移、粘附及增殖等，且在維持肌動蛋白動力學(xué)、調(diào)控細(xì)胞極化和腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用。該研究選取2010年1月—2014年12月該院收治的85例患者為研究對象，旨在對結(jié)直腸癌中FAT1表達(dá)進(jìn)行檢測，分析FAT1與臨床病理特征之間的關(guān)系，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對FAT1基因的表達(dá)予以上調(diào)或抑制，觀察FAT1對腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院腫瘤外科收治的85例結(jié)直腸癌手術(shù)患者作為研究對象，均于入院，并收集所有患者的癌組織標(biāo)本及配對的癌旁正常腸黏膜標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者的臨床病理資料完整；②術(shù)前均未行放化療或靶向藥物治療；③術(shù)后經(jīng)病理確診為浸潤性腺癌。納入研究的患者中，男性49例，女性36例，年齡為46～82歲，平均為（62.5±9.6）歲。所有患者分期參考TNM分期系統(tǒng)。人腸癌細(xì)胞株SW620購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。該研究經(jīng)倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

RT-PCR檢測FAT1 mRNA的表達(dá)：通過顯微切割選取具有代表性的區(qū)域，3張厚度為5μm的切片。總RNA的提取選取ReliaPrepTMFFPE Miniprep Systems。cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成選取RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)，72℃延伸5 min。EnVision法免疫組化染色檢測FAT1蛋白的表達(dá)：選取二甲苯對切片進(jìn)行脫蠟處理，梯度酒精水化，微波抗原修復(fù)，修復(fù)時間控制在2 min左右，于室溫下置入3%H2O2內(nèi)浸泡，浸泡時間控制在10 min左右，10%FBS室溫封閉15 min后將小鼠抗人FAT1單克隆抗體(稀釋度1：1 000)置入，于4℃環(huán)境下孵育過夜，復(fù)溫之后將第二抗體置入，置入時間控制在30 min左右，經(jīng)DAB顯色與蘇木素復(fù)染。參考相關(guān)學(xué)者[2]在相關(guān)研究中選用的方式，結(jié)合染色強(qiáng)弱（0代表陰性;1代表弱陽性;2代表中等陽性;3代表強(qiáng)陽性）與陽性細(xì)胞比例（0代表無;1代表＜10%;2代表10%～50%;3代表51%～80%；4代表＞80%）乘積對免疫反應(yīng)進(jìn)行評估。根據(jù)分值劃分為不同程度表達(dá)，即低（1～3分）、中（4～8分）及高（9～12分）。Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力：構(gòu)建Lv-FAT1-EGFP表達(dá)載體和psiLv-U6-FAT1 RNA干擾載體并轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染時間達(dá)24 h之后，選取無血清培養(yǎng)基培制1×105/mL細(xì)胞懸液，然后于Transwell上室接種100μL細(xì)胞懸液，并將含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基500μL置入Transwell下室內(nèi)。于37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，選取棉簽將上室細(xì)胞擦除，4%多聚甲醛固定之后進(jìn)行DAPI染色，于100倍鏡下選取5個不同的視野，對遷移細(xì)胞平均數(shù)量進(jìn)行測算。細(xì)胞侵襲實驗開展過程中應(yīng)預(yù)先選取Matrigel膠包被Transwell上室，其余步驟與細(xì)胞遷移實驗相同。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)選取SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料用（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，F(xiàn)AT1與病理參數(shù)相關(guān)性分析選取Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAT1表達(dá)及病理特征分析

RT-PCR發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織、結(jié)直腸癌組織較正常腸黏膜組織FAT1 mRNA表達(dá)水平更高（P＜0.05）。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中FAT1蛋白為高表達(dá)（見圖1）。3種組織內(nèi)FAT1蛋白均有表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度呈遞增趨勢（見表1）。在納入該研究的85例結(jié)直腸癌中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與FAT1表達(dá)密切相關(guān)（P＜0.05），同腫瘤分化程度及部位與患者性別及年齡等無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表1 FAT1在不同組織中的表達(dá)情況[n(%)]Table 1 FAT1 expression in different tissues[n(%)]

圖1 FAT1在不同組織中的表達(dá)（×200）Figure 1 FAT1 expression in different tissues(×200)

表2 85例結(jié)直腸癌組織中FAT1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）Table 2 Relationship between FAT1 expression and clinicopathological parameters in 85 cases of colorectal cancer（n）

2.2 FAT1對腸癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力的影響

Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT1過表達(dá)會增強(qiáng)SW620細(xì)胞株的侵襲能力，并促進(jìn)其遷移（P＜0.05），見圖2。

圖2 SW620細(xì)胞株侵襲及轉(zhuǎn)移中FAT1的影響圖2 Figure 2 Effect of FAT1 on invasion and metastasis of SW620 cell line

3 討論

結(jié)直腸癌是一種惡性腫瘤病癥。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計學(xué)資料顯示,我國2015年結(jié)直腸癌發(fā)生率約為28.2/10萬，病死率約為13.61/10萬[3]。結(jié)直腸癌的發(fā)病率城市遠(yuǎn)高于農(nóng)村，尤其是上海、江蘇等東部沿海地區(qū)。現(xiàn)階段，防治結(jié)直腸癌已成為我國醫(yī)學(xué)研究熱點。因早期階段結(jié)直腸癌患者無明顯癥狀及體征，多數(shù)患者確診時已進(jìn)展至中晚期，預(yù)后較差。FAT1屬于鈣黏蛋白超家族成員，最早由相關(guān)研究[4]在果蠅發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)。FAT1基因定位于人類4號染色體長臂（4q35.2），分子結(jié)構(gòu)及功能分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域能夠Ena/VAPS、Scribble以及線粒體內(nèi)膜相關(guān)蛋白等結(jié)合，發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。目前，腫瘤發(fā)生、能量代謝及細(xì)胞生長調(diào)控等過程中FAT1發(fā)揮的作用受到了越來越多的關(guān)注。

目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT1在膽管細(xì)胞癌、乳腺癌、口咽部鱗狀細(xì)胞癌、彌漫性星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)。相關(guān)學(xué)者[5]對22例膽管細(xì)胞癌進(jìn)行免疫組化染色檢測，發(fā)現(xiàn)FAT1在胞膜表達(dá)減弱與腫瘤的組織學(xué)分級和增殖指數(shù)顯著相關(guān)，提示FAT1可能參與了膽管細(xì)胞癌的惡性演進(jìn)。相關(guān)學(xué)者[6]在裸鼠體內(nèi)成瘤實驗中證實，利用轉(zhuǎn)染shRNA下調(diào)PLC肝癌細(xì)胞株FAT1的表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延遲成瘤時間。最近，有學(xué)者[7]通過體外細(xì)胞實驗證實，靶向FAT1可通過LRP5/WNT2/GSS信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并增強(qiáng)口腔鱗狀細(xì)胞癌對順鉑的敏感性。該研究檢測發(fā)現(xiàn)鄰近正常腸黏膜組織中FAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平5.9%、0.0%，明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織34.3%、60.0%及結(jié)直腸癌組織36.5%、42.4%（P＜0.05），這與Piero等[8]的研究結(jié)果相一致，在其研究中，鄰近正常腸黏膜組織中FAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平為5.7%、0.2%，低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織及結(jié)直腸癌組織。分析FAT1與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FAT1的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），提示FAT1可能與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，該研究利用體外細(xì)胞實驗進(jìn)一步證實，F(xiàn)AT1表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)腸癌細(xì)胞株侵襲能力，并促進(jìn)其遷移。

綜上所述，結(jié)直腸癌中FAT1呈高表達(dá)狀態(tài)并與腫瘤侵襲及遷移有著密切關(guān)聯(lián)，表明結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展中FAT1可能發(fā)揮著十分重要的作用，有望成為治療新靶點。FAT1在結(jié)直腸癌中的具體調(diào)控機(jī)制仍然有待深入研究。